致病性结核杆菌特异性IgG抗体ELISA检测方法的初步建立

为建立鉴别致病性结核杆菌感染和卡介苗接种产生的IgG抗体,分别用结核杆菌的混合抗原TB1、TB2和PPD包被,以结核病患者血清为阳性对照,以PPD试验阴性健康人血清作为阴性对照,建立了TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA三种检测结核杆菌抗体的方法。20份阳性标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的阳性检出率分别为45%、50%、95%,100份健康人血清标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的符合率为93%、90%、68%。研究工作为研发致病性结核杆菌感染IgG抗体检测试剂奠定了一定基础。     

检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用

以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。     

检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

依据F种肠道病毒(enterovirus species F,EV-F) SD-S67毒株的基因组序列设计合成引物,RT-PCR扩增出该毒株的VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ/EcoRⅠ位点,表达出VP1重组蛋白。以纯化VP1重组蛋白为免疫原,制备兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立了检测F种肠道病毒的双抗体夹心ELISA方法,同时对山东和河南省部分地区牛群感染EV-F进行了初步的流行病学调查。结果显示,捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,HRP酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶400;确定的方法判断标准为样品的D₄₉₀>0.217时判定为阳性。建立的ELISA方法可以特异性检测出EV-F病毒抗原,而EV-E和BVDV病毒抗原检测结果均为阴性,表明方法具有较好的特异性。以建立的ELISA方法检测不同稀释倍数的阳性样品,结果稀释1 000倍后的样品检测结果仍为阳性,表明建立的方法具有较高的敏感性。应用建立的方法检测部分样品,组内变异系数为1.05%～9.24%,组间变异系数为1.39%～6.78%,说明该方法具有良好的重复性。同时...     

倍他米松ELISA检测方法的建立

为建立倍他米松(BET)ELISA检测方法,先使BET与琥珀酸酐反应,再采用活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原;其次,利用免疫动物获得多克隆抗体,经Sephrose 4B-proteinA方法对抗体进行纯化;最后,建立倍他米松ELISA检测方法。结果表明,免疫抗原偶联成功,获得了亲和力较高的多克隆抗血清,间接竞争ELISA测定其滴度为102 400、IC15为6.60×10-5 ng/mL和IC50为0.97ng/mL。该方法适用于残留在动物性食品中的BET现场大批量检测。     

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1：160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1：200,酶标记抗体的最佳稀释度为1：400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。     

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白（Mature chicken interleukin-18,mChIL-18）的2株单克隆抗体（mAb）1G9和2E6,建立检测mChlL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg／L,检测抗体的工作效价为1：800,待检样品的最佳稀释度为1：400,检测敏感度可达31．5ng／L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著（P〈0．05）。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。     

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白(Mature chicken interleukin-18,mChIL-18)的2株单克隆抗体(mAb)1G9和2E6,建立检测mChIL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg/L,检测抗体的工作效价为1∶800,待检样品的最佳稀释度为1∶400,检测敏感度可达31.5ng/L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著(P<0.05)。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。     

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法.用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应.攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV.该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具.     

产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

为了对产气荚膜梭菌α毒素进行快速、有效的检测,本研究以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)为基础,建立了双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。纯化原核表达的α毒素蛋白为免疫原,制备腹水型mAb并分离纯化作为检测抗体,免疫新西兰大白兔制备抗α毒素多克隆抗体纯化后作为捕获抗体,通过试验优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.86³75μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A375μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A^E型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中,α毒素含量差异较大,A型菌(NCTC528)中α毒素含量显著高于其他菌型。本研究成功制备了高特异性的mAb,并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法,为高效检测α毒素提供了有效工具。     

胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立

制备配对胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)单抗,建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夹心ELISA检测方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0融合,用HAT培养基进行筛选培养,间接ELISA检测阳性克隆,对阳性孔进行多次单克隆化,选出效价高、分泌性能稳定的杂交瘤细胞,制备腹水并进行纯化。进行单抗配对,建立胃蛋白酶原Ⅱ双抗体夹心检测方法。获得1D8、1C6、2H11、2E3等4株杂交瘤,经配对试验,确定1D8、2H11可作为夹心ELISA检测PGⅡ的单抗。成功制备出配对单抗,初步建立了PGⅡ双抗体夹心ELISA方法。     

大片形吸虫病早期诊断夹心ELISA方法的建立及应用

为建立一种早期诊断大片形吸虫病的试验方法,本试验对5株分泌抗大片形吸虫分泌排泄抗原(ES)单克隆抗体的杂交瘤细胞进行复苏、制备单克隆抗体,配对筛选出7D1、7D2单克隆抗体,将7D2作为包被抗体,7D1作为酶标抗体,通过条件优化,建立早期诊断大片形吸虫病的夹心ELISA方法。结果显示,当包被抗体稀释度为1:6 400 (0.208 μg/mL)、采用5%脱脂奶粉封闭、酶标记抗体稀释度为1:10 000 (0.200 μg/mL)时,最早可检测到感染此病第7天小鼠的血清循环抗原,其敏感性可达到1:3 200 (0.156 μg/mL),与其他几种寄生虫抗原均无交叉反应,具有较高的特异性和稳定性。本试验成功建立了早期检测大片形吸虫病的夹心ELISA方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断大片形吸虫病的试剂盒奠定了基础,具有临床应用价值。     

Development and Application of Sandwich ELISA for Diagnosis of Fascioliasis gigantica in Early Stage

To establish a method for the diagnosis of Fascioliasis gigantica in early stage, five hybridoma cell lines were recovered and used for preparation of monoclonal antibodies.7D2 was used as a capture antibody and 7D1 as detection antibody.Coating antibody dilution was 1:6 400 (0.208 μg/mL), 5% nonfat milk was used as blocking solution and detection antibody dilution was 1:10 000 (0.200 μg/mL).The detection limit of the sandwich ELISA was 1:3 200 (0.156 μg/mL), with good specificity and stability, and there was no cross reaction with other kinds of parasite antigen.The results showed that the method provided the important conditions and theoretical basis for the diagnosis of Fascioliasis gigantica in early stage. This would save unnecessary economic losses to the livestock, and it had clinical application value.     

甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

建立甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件,并进行Western bloc和血凝试验鉴定.用纯化蛋白制备单克隆抗体,建立检测甲型H1N1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,对其交叉反应、符合率进行验证.结果表明,HA蛋白在BL21 (DE3)中...     

兔病毒性出血症病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及其临床应用

为了建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的RHDV基因序列,RT-PCR扩增了长约510bp的VP60基因片段,连接PGEX-4T-1表达载体后获得了以包涵体形式表达的重组VP60蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为RHDV的快速诊断、免疫兔群抗体监测和实验兔等级检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立

用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株（2G9,3E5）可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗（3E5）包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。     

鹿流行性出血病病毒双抗夹心ELISA方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,用纯化的抗EHDV特异性单克隆抗体包被ELISA板,用兔抗EHDV IgG作为夹心抗体,IgG作为夹心抗体建立EHDV双抗夹心ELISA方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了试验.用ELISA分别检测EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、水疱性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒...     

夹心ELISA检测鹿粘膜病病毒的研究

建立了检测鹿粘膜病毒 (MDV)抗原的双抗体夹心ELISA。试验方法的最佳工作条件 :抗体包被量为 1 0 0 μg/孔 ,酶标抗体的稀释度为 1∶40 0倍。对吉林省某地鹿场的鹿粪样的检查结果表明 ,该鹿场的MDV阳性率为 32 %。     

牛附红细胞体病双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

用过碘酸钠改良法制备酶标抗体,建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验结果表明:抗体最适包被量为156μg/mL;酶标抗体最适工作浓度为1∶400;抗原及酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃、1 h;封闭液为5%犊牛血清;底物显色时间为15 min;对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL;全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1∶160和1∶40,可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验,结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,并适合作群体检测。     

羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

为快速准确诊断和检测羊附红细胞体病,及时采取防治措施,建立了检测羊附红细胞体抗原的双抗夹心ELISA诊断方法。选取规模化养殖场羊,镜检附红细胞体红细胞感染率> 90%,无菌采取血液,分离羊附红细胞体抗原,制备纯化兔抗羊附红细胞体抗体,应用辣根过氧化物酶标记抗体,进行双抗体夹心ELISA试验。试验结果表明,双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:抗体最佳包被量为82.91 μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为7.81 μg/mL;而且与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌以及牛、猪、兔附红细胞体均不出现交叉反应,表明该方法具有良好的特异性,可用于羊附红细胞体病的诊断和群体检测。     

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。