果树转基因应用研究

转基因技术在果树研究的各领域得到广泛应用,并取得一定成绩。现从果树转基因技术的应用现状,影响果树基因转化效率的因素,转化植株的筛选及转基因安全问题等方面对果树转基因应用的研究进行了综述。     

以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体系的建立及功能鉴定

 从东北地区高pH盐碱地上生长良好的羊草中克隆Lc14-3-3基因，以露地菊（Chrysanthemum morifolium）‘火焰’叶片愈伤组织为受体，以农杆菌介导，将Lc14-3-3基因转入‘火焰’基因组中。以载体中的磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）为筛选标记，通过甘露糖的筛选，结合PCR、Southern杂交检测Lc14-3-3整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见转化Lc14-3-3基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地菊遗传转化。     

Cry2Aa2 和PamPAP 双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化

 为了获得既抗虫又抗病毒病，又对人体和环境安全的转基因辣椒（Capsicum annuum L．）材料，将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter 及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP 一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI 的多克隆位点上，构建双价表达载体，采用农杆菌介导法将其转入辣椒中，并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR 扩增和Southern 杂交检测，结果表明Cry2Aa2和PamPAP 已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR 分析，证实Cry2Aa2 和PamPAP 在T₀ 代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定：T₀ 代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒（CMV）和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。     

木本果树遗传转化研究进展

从遗传转化方法和影响遗传转化的因素两方面综述了木本果树遗传转化技术近年来的进展。木本果树遗传转化方法主要有农杆菌介导法和基因枪法;影响转化的因素主要从受体与再生系统、选择标记基因与转化细胞的筛选、培养方法与培养条件等方面进行论述。文章还归纳了导入目的基因并获得再生植株的木本果树种类,并对木本果树基因工程进展及展望进行了讨论。     

我国果树转基因的研究概况

近年来,在果树研究的各领域,转基因技术广泛应用,并取得一定成绩.该文从果树转基因的发展、主要方法、导入果树中的外源目的基因及影响果树基因转化效率的因素4个方面对我国果树转基因的研究进展进行了综述.     

利用pmi作为筛选基因对辣椒进行Bt基因转化的研究

根据Cry2Aa2的保守基因序列设计引物,从而扩增出完整的Cry2Aa2序列,连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）的表达载体pCAMBIA1301-PMI上,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗虫试验,72h后统计抗虫情况。结果表明：获得了含有Cry2Aa2转基因植株;食用转Bt基因辣椒叶片和果实的斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率均高于阴性对照,且大多表现出僵化和厌食的状态,对转基因的辣椒伤害较小,说明Bt基因成功导入辣椒中。     

露地菊离体再生体系建立及BrDFR基因遗传转化

 以露地菊（Chrysanthemum morifolium）品种‘神韵’无菌苗叶片为外植体材料,研究植物生长调节剂配比对其愈伤组织诱导再生芽的影响,以建立离体再生体系。研究结果表明,露地菊‘神韵’在含NAA 1.0 mg · L^-1 + BA 1.0 mg · L^-1的MS培养基上获得了最高的再生芽分化率。利用已经克隆的‘津田’芜菁BrDFR基因构建非抗生素筛选的表达载体。以露地菊‘神韵’的无菌苗叶片为受体,通过农杆菌介导进行BrDFR基因的遗传转化。以载体的PMI基因为筛选标记,通过甘露糖筛选获得了‘神韵’的遗传转化再生植株。经过PCR验证和Southern杂交检测证实BrDFR基因已经整合到‘神韵’基因组中。     

木糖筛选系统在蔬菜遗传转化上的应用

随着蔬菜转基因技术的不断发展及转基因产品的商品化，公众对抗性标记基因及其产物安全性的质疑成为植物转基因面临的一个重要问题。构建基于生物安全标记基因的遗传转化体系是当前植物转基因的发展趋势之一。主要介绍了以木糖作为筛选剂的安全转化系统在蔬菜基因工程育种上的应用。     

果树基因工程研究进展

利用农杆菌介导、生物导入和DNA直接摄取技术,现已转化了包括苹果在内的10多种果树,获得了一些携有抗虫、抗病毒基因的转基因植株.但是,获得果树的转基因植株仍然是比较困难的,这是木本植物再生能力较差和转化效率较低之故.综述了近年来果树基因工程取得的成就及基因工程对果树遗传改良的作用和意义.     

兰花遗传转化技术研究进展

兰花是世界重要的盆栽观赏植物和切花花卉,利用转基因技术进行兰花基因工程育种和基因功能研究是近年来兰花育种的热点,而高效稳定的兰花遗传转化体系的建立是兰花基因工程育种的关键基础。现综述了近年来兰花遗传转化的研究进展,包括转化受体、转化方法、影响转化效率等相关因素,以期为兰花遗传转化技术的提高、转基因新品种的培育等研究提供参考。     

转基因苹果研究进展

十多年来,转基因技术以其独特的魅力在苹果上得到了迅速发展。目前,农杆菌介导法是苹果上应用的主要转化方法,叶片再生不定芽途径是被广泛应用的受体系统。影响这一受体系统的主要因素有基因型、外植体的来源、叶片发育阶段及生理年龄、培养条件以及抗生素等。而菌株的类型、侵染时间、共培养的时间和条件、酚类物质及转化植株的选择方式等则影响基因的转化。已有多种标记基因和目的基因转入苹果中,且遗传分析表明外源基因能够稳定遗传。但依然存在转化效率不高、外源基因表达强度不够、可转化的目的基因有限及对转化植株的选择不够重视等诸多问题。综合有关文献对上述问题进行了讨论并对转基因苹果的前景进行了展望。     

根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系研究

研究建立了根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系.结果表明最佳的不定芽诱导分化和继代培养基为:MS 6-BA1.5 mg/L NAA0.2 mg/L;选择培养基中30 mg/L卡那霉素和300 mg/L的头孢霉素是适宜的抗生素使用浓度;侵染过程中0.05 MPa负压处理5 min和共培养过程中添加20 mg/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经2次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PGR-Southern杂交,证实外源基因已整合进入矮牵牛基因组中.     

草莓主栽品种再生和转化的研究

 建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系和遗传转化体系, 获得了转基因植株。‘弗吉尼亚’和‘森嘎拉’的叶片离体再生芽频率达到100 %。试管苗叶片与农杆菌菌株EHA105 共培养3 d。共培养后的叶片在附加卡那霉素40 mg/L 的再生培养基上选择培养4周后, 外植体再生出转化芽, 弗吉尼亚的转化芽再生频率可达6. 8 %。采用组织化学染色法对随机选取的10 个GUS 基因转化植株进行基因表达测定, 结果5 个植株强烈表达GUS 活性。转bar 基因植株在附加除草剂草丁膦10 mg/L 的培养基上能够正常分化, 在田间对草丁膦表现出强烈抗性。转基因植株开花、结果正常。     

Evaluation of an alternative D-amino acid/DAAO selection system for transformation in apple (Malus × domestica Borkh.)

Summary

The conventional selection system for apple transformation is based on the selectable marker gene, nptII, encoding antibiotic resistance against kanamycin. We tested an alternative selection system based on the use of D-amino acids using the gene, D-amino acid oxidase 1 (dao1) as the selectable marker, in order to avoid the presence of antibiotic resistance genes in the resulting transgenic apple plants. In addition, dao1 allowed the selection as well as the elimination of dao1-transgenic plants, based on differences in the toxicity of different D-amino acids. Regeneration experiments using apple leaf explants revealed that 2 mM D-serine or D-alanine inhibited shoot regeneration. We performed transformation experiments using the apple cultivars ‘Gala’, ‘Holsteiner Cox’, and a progeny of the apple cultivar ‘Pinova’, and the vector p35S::dao1-intron, containing the dao1 and nptII selectable marker genes. Several shoots regenerated successfully on selection media containing various concentrations of D-serine or D-alanine, but transgenic shoots were not obtained. However, three dao1/nptII transgenic apple lines were obtained after selection with kanamycin, indicating that the vector was functional. Furthermore, we showed that 20 mM D-serine could be used to select dao1-transgenic shoots from non-transgenic in vitro shoots, whereas 13 mM D-isoleucine had the opposite effect.     

提高苹果基因转化效率的研究

采用根瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）强株系ＥＨＡ１０５（ｐ３５ｓＧＵＳ－ｉｎｔｒｏｎ）研究了影响‘皇家嘎拉’苹果（Ｍａｉｎｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）外植体的β-葡萄糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的瞬时、稳定表达水平和转基因植株的再生。证明在培养基生长素（ＩＢＡ、ＮＡＡ）存在的条件下,外植体的ＧＵＳ基因的瞬时表达水平提高了３－４倍,而共培养两周后稳定表达水平提高２倍以上,产生９．８个ＧＵＳ愈伤组织表达区域。白化处理促进外植体的基因转化,白化处理的新梢顶端第一节间外植体ＧＵＳ表达区域比常用的叶片外植体高４倍。在生长素存在的条件下 ２％外植体获得了转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＢｌｏｔＤＮＡ杂交和组织化学染色分析证明ＧＵＳ基因已整合到苹果的染色体上,并得以表达。     

基因枪法和农杆菌介导的Bt抗虫基因转化芥蓝

以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子叶下胚轴为外植体、预培养2d、侵染10min、共培养2d、抑菌培养5d后转入筛选培养基为最佳参数,转化效率为0.37%。经PCR和PCR-Southern鉴定,基因枪法和农杆菌介导转化法均成功将目的基因导入芥蓝基因组中。经抗虫性表型鉴定,T_0代转基因芥蓝植株对甘蓝夜蛾幼虫的抗性高于非转基因植株。     

芜菁花叶病毒CP基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化

 针对芜菁花叶病毒外壳蛋白基因构建反向重复表达载体,利用农杆菌介导法将其导入四九菜心,PCR检测共获得13个阳性转化株,遗传转化效率为2%。     

无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用

在广为应用的植物转基因技术中,绝大多数采用各种抗性基因作为选择标记,而这正是转基因植物对生态环境和食品、药品安全影响的隐患所在。目前主要通过无抗性选择标记转基因技术即安全选择标记的利用和标记基因删除法来克服这一问题。本文对正在应用的安全选择标记和标记基因删除法的最新研究进展及其在蔬菜作物上的应用情况进行综述,并简要分析了各方法的利弊和发展前景。     

Genetic transformation of Prunus domestica L. using the hpt gene coding for hygromycin resistance as the selectable marker

The study and development of transformation technology with new selection schemes is important for various fundamental studies and for crop trait improvement via genetic engineering. Here we have shown that hygromycin resistance is an effective system for plum genetic transformation. Embryonic axes of mature seeds were co-cultivated with Agrobacterium strain LBA4404 containing the pC1381 plasmid carrying the hygromycin phosphotranferase gene (hpt) and β-glucuronidase (GUS) gene or with strain EHA105 containing the plasmid pC1301 carrying the same marker and reporter genes. The latter strain containing a pC2301 plasmid carrying the neomycin phosphotransferase gene (nptII) gene was used as a control. Infected explants were placed on shoot induction medium containing either 5 mg L⁻¹ hygromycin or 75 mg L⁻¹ kanamycin for selection. Green shoots developed from the explants under hygromycin pressure. These shoots showed continued and vigorous growth and development upon transfer onto fresh hygromycin medium. PCR using hpt sequence primers, and Southern blot analysis using a probe from the hpt gene, confirmed the presence of the transgenes and their stable integration in regenerated plants. Full transgenic plants were obtained in a greenhouse. Hygromycin selection was very effective and no escapes were observed. The study demonstrated that hygromycin resistance can be used as an effective selectable marker for plum transformation. The new system developed here is important and useful for multiple gene transformation in plum.