砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

 以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc. ) 幼果cDNA第1链为模板, 参照大麦钙调蛋白基因序列(Accession No. M27303) 合成5p端和3p端引物, 以PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白cDNA, 将其克隆到PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明, 柑橘钙调蛋白cDNA全长453 bp, 共编码148个氨基酸, 与大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达83%以上, 所编码氨基酸序列同源性达97%以上。以该cDNA作探针进行点杂交, 得到良好的杂交信号。     

梅PGIP基因的克隆及全序列分析

 通过PCR扩增, 从梅基因组中得到1条全长1 192 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白( PGIP)基因序列。该序列包含有1个完整的开放阅读框和1个内元。比对结果表明, 克隆到的序列与桃、马哈利樱桃中相应序列一致度分别为96%和95% , 其蛋白质序列与桃、马哈利樱桃的蛋白质序列一致度分别为97%和94%。该蛋白质序列中包含着一段亮氨酸重复序列。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

将来自北京地区甘蓝和芥菜上的TuMV外壳蛋白基因片段分别克隆到pMD18-T载体中,测序并进行序列分析。结果表明:两者CP基因序列长度均为867个核苷酸,编码288个氨基酸,它们的核苷酸同源性为97·2%,氨基酸同源性为97.6%;两者与GenBank中的部分CP基因序列的核苷酸同源性在87.8%~97.8%之间,氨基酸同源性在91.7%~99.0%之间;分子进化树分析两者可归属World-B组。     

甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甜菜蔗糖磷酸合成酶（Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS）是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列（Genbank accession no.X X81975）,利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

苦瓜afp1基因的克隆与序列分析

通过异硫氰酸胍法提取苦瓜总RNA,采用一步RT-PCR方法获得394 bp苦瓜afp1基因序列.应用DNA star软件进行序列分析,表明这个片段包含了基因完整的编码.Blast分析表明,它与荠菜的防卫基因有很高的同源性,序列一致率为87％.该试验结果将为分子植物抗病育种提供基因材料.     

草菇丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因的克隆及序列分析

根据担子菌丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因编码的氨基酸序列设计两对简并引物,通过巢式简并PCR方法获得草菇(Volvariella volvacea)丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因(vv-stpk1)的保守片段,然后通过基因组步行的方法获得了vv-stpk1全长序列。vv-stpk1全长为2 003 bp,含有8个内含子,长度分别为72、57、53、54、45、50、55和48 bp,可编码522个氨基酸残基的多肽。推定的氨基酸序列与玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、木糖发酵酵母(Pichia stipitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)中与细胞形态发生相关的丝/苏氨酸蛋白激酶Orb6的相似性分别为81%、77%和76%,对VV-STPK1蛋白的系统发生学分析的结果表明,VV-STPK1与Orb6同源蛋白聚在同一进化枝上,这些数据都支持VV-STPK1蛋白为与细胞形态发生相关同源蛋白的推定。     

香蕉果实果胶裂解酶基因cDNA克隆及序列分析

利用已报道果胶裂解酶基因的保守序列设计简并引物,进行RT-PCR,得到1个大约1300bp的香蕉果胶裂解酶基因cDNA片段,命名为MA-pl。DNA序列分析表明:MA-pl片段全长1277bp,包含1个882bp的开放读码框(ORF),编码294个氨基酸;其具有所有果胶裂解酶共有的保守区域:钙协调部位(Asp72,Asp74,Asp96,andAsp100)、酶活性位点(Arg152,Pro154,Arg157)及3个重要的结构域(motifI:WVDH,motifII:DGLVDAVMGSTAITVSNNYF,motifIII:LYQRMPRCRHGYFHVVWNDY);MA-pl氨基酸序列与草莓-1、葡萄、草莓-2、拟南芥、苹果、香蕉(banana-1)的相似性分别为85.8%、74.2%、79.7%、78.6%、72.4%和71.4%。     

沙田柚RNase-like基因的克隆及序列分析

以沙田柚自交和异交花柱为试材,采用高通量测序技术对其进行转录组测序。通过差异分析得到RNase-like贮藏蛋白的基因序列,并研究了其理化性质。结果表明:该基因全长1 048bp(GenBank登录号为KR363153),开放阅读框(ORF)全长为693bp,共编码230个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为25.82kDa,理论等电点为5.30,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2超家族成员。该蛋白为疏水性蛋白,可能的磷酸化位点共有15个。氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的氨基酸与甜橙和克莱门柚的同源性均为99%。系统进化树显示沙田柚RNase-like贮藏蛋白基因与甜橙,克莱门柚的亲缘关系较近,属于同一进化分支。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

银耳芝麻蛋白饮料的工艺及稳定性研究

以银耳、白芝麻为主要原料,经过制浆、调配、均质、灌装、杀菌等加工工艺,通过正交实验确定了银耳芝麻蛋白饮料的最佳配方.同时由于芝麻含有大量的油脂,因此对蛋白饮料的稳定性进行了简单的研究,并且通过正交实验确定了最佳乳化稳定剂的配比.结果表明:最佳配方是银耳浆添加量为25％,芝麻浆添加量为30％,蔗糖添加量为6％;最佳乳化稳定剂配比是黄原胶为0.10％,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为0.03％,单甘脂为0.20％,蔗糖酯为0.10％.     

砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。     

甘蓝和油菜中类硫氧还蛋白THL2基因的克隆与序列分析

 采用PCR和RT-PCR方法，对甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA进行扩增，获得了类硫氧还蛋白THL2的DNA和cDNA。序列分析首次表明THL2基因有两个内含子，并且在油菜和甘蓝中的大小不同。进一步分析表明，油菜和甘蓝中THL2 DNA序列的同源性为96％。     

哈茨木霉Thi4基因的克隆与序列分析

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是一种丝状土壤真菌,作为一种优秀的生防因子在植物病害防治过程中发挥着重要的作用.为研究其生防机制并获得生防相关基因,构建了菌丝生长期cDNA文库,通过对部分ESTs序列的测定与生物信息学分析,成功获得了噻唑生物合成酶基因Thi4的全长cDNA序列.Thi4基因全长1311bp,包含一个编码322个氨基酸残基长度为969bp的开放读码框,编码蛋白理论分子量为34.5kDa,等电点为5.18.基因的氨基酸序列含有多个功能性位点且在进化上保守.将基因提交国际权威基因数据库GenBank,序列号为DQ647956.     

石斛兰dfr基因的克隆、序列分析及原核表达

二氢黄酮醇4 - 还原酶(DFR) 在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因, 并命名为Dendfr。该序列全长1 164 bp, 编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现, DenDFR与3种兰科植物的DFR氨基酸序列同源性达81% ～86% , 与其他非兰科植物的DFR氨基酸同源性在56% ～72%之间。在Den DFR N - 末端存在一个保守的NADP结合区, 序列中存在26个氨基酸组成的底物特异结合区, 其中134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺N位点。将Dendfr的编码区克隆到pQE30载体中, 在大肠杆菌中高效表达了该蛋白, 为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基础。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

杧果MADS-box基因保守区片段的克隆与序列分析

为从杧果中克隆新的MADS-box基因,利用MADS-box转录因子的保守特征设计简并引物,应用RT-PCR从杧果花序中成功分离出14条MADS-box基因cDNA片段。片段长度在138~147bp之间,推导的氨基酸序列与已知的杧果MADS-box基因的同源性为65.2%~82.6%。用推导的氨基酸序列与已知的杧果和拟南芥MADS-box基因进行系统发育分析,可将这些片段归入MADS-box的不同亚家族中。表明杧果花序中存在多种MADS-box转录因子,参与杧果花器官的发育及开花时间的调节。