来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。 doi1基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。     

来源于云斑天牛肠道细菌Pseudomonas sp. TN06的β-折叠桶植酸酶基因phyA06的克隆、表达和酶学性质研究

从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因(phyA06),开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0~10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。     

施氏假单胞菌YC-YH1对甲基对硫磷的降解及其代谢产物检测

利用实验室已获取的菌株YC-YH1对甲基对硫磷进行降解,以高效液相色谱结合质谱分析(HPLC-MS)测定菌株YC-YH1对甲基对硫磷的降解速率并检测其代谢产物,通过基因克隆研究菌株YC-YH1对甲基对硫磷降解的分子机制,同时分析代谢产物对菌株YC-YH1生长的影响.结果表明,菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),能够高效降解甲基对硫磷,其同时含有甲基对硫磷水解酶基因mpd和有机磷水解酶基因ophC2.经质谱分析确定,菌株YC-YH1将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚和二甲基硫代硫酸酯,其中对硝基苯酚显著抑制YC-YH1的生长.综上,施氏假单胞菌YC-YH1能够高效地降解甲基对硫磷,但对硝基苯酚作为其代谢产物对YC-YH1的生长存在显著抑制作用.     

1株氟环唑降解菌的分离鉴定及降解特性

从废弃农药厂周边土壤中分离筛选得到1株以氟环唑为唯一碳源的降解菌,命名为F1。经过对菌落菌体的形态观察、16S rRNA序列相似性及系统发育分析,初步鉴定其为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株,其亲缘关系与昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)最近。进一步优化F1降解氟环唑的条件,结果表明,氟环唑初始浓度为20 mg/L、温度为30℃、pH值为7.0时,菌株降解氟环唑的效果最佳。在最佳条件下,接入菌悬液使无机盐液体培养基在600 nm处的吸光度(D_(600 nm))为0.1,培养4 d后,菌株达到生长高峰,培养6 d时氟环唑降解率达90.4%。研究还发现,增加接菌量能明显提高F1对氟环唑的降解效率。     

二硝基重氮酚（DDNP）废水中的硝基酚类化合物污染土壤对2种蔬菜种子萌发与生长的影响

以上海青、小白菜2种蔬菜种子为材料,研究受二硝基重氮酚 (DDNP)废水污染（以硝基酚类化合物计）的土壤对种子萌发、根或芽伸长及光合与呼吸作用强度的影响。结果表明,土壤硝基酚类化合物含量在0~12 mg/kg时,对上海青、小白菜的发芽率有不显著(P>0.05)的促进作用,超过24 mg/kg时,上海青发芽率受明显抑制,达到36 mg/kg时,受污染土壤明显抑制小白菜发芽率;2种蔬菜根和芽伸长抑制率与污染土壤中硝基酚类化合物含量呈显著线性相关（P<0.01）,上海青根和芽伸长的IC₅₀分别为60.39、99.34 mg/kg,小白菜根及芽伸长的IC₅₀分别为65.48、109.89 mg/kg,对于硝基酚类化合物污染,上海青较小白菜更敏感,对同一种作物,根较芽更敏感;随着土壤中硝基酚类化合物含量的增大,2种蔬菜光合作用所利用的CO₂量及呼吸作用所产生的CO₂量均呈下降趋势,DDNP废水污染土壤会影响植物光合及呼吸作用,引起机体受损。     

降解2,4-二氯酚的假单胞菌GT241-1的特性及其3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因定位

从2,4-二氯酚生产厂排污口污泥中分离并筛选到一株降解2,4-二氯酚的细菌GT241-1，经鉴定属假单胞菌属。菌株GT241-1能在48h内将90mg/L的2,4-二氯酚降解91%。GC/MS分析表明，该菌株能将2,4-二氯酚彻底降解而不积累中间代谢产物。经38℃热处理，菌株GT241-1中有1.9%丧失了2,4-二氯酚降解能力。菌株GT241-1有两条大质粒带。Southern杂交表明，菌株GT241-1的3,5-二氯儿茶酚1，2-双加氧酶基因定位于约11kb的EcoRI/XbaI酶切片段。     

2-硝基-4'-羟基二苯胺(HC Orange No.1)在鲫鱼肝脏中的富集及其对肝脏抗氧化指标的影响

采用室内模拟方法研究了2-硝基-4'-羟基二苯胺(HCOrangeNo.1)在鲫鱼(Carassiusauratus)肝脏中的富集规律及不同暴露时间对鲫鱼肝脏抗氧化指标的影响。结果表明,10d左右鲫鱼肝脏对HCOrangeNo.1的富集达到最大值,肝脏过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)及还原型谷胱甘肽(GSH)对HCOrangeNo.1都非常敏感,其中GST活性和GSH含量总体上被诱导增加;SOD和CAT活性基本上都是先升高后受到抑制。上述抗氧化指标可考虑作为水生生态系统中HCOrangeNo.1污染的生物监测指标。     

鞘氨醇胞菌B1咔唑降解基因carB的克隆与功能研究

以分离到的咔唑高效降解菌鞘氨醇胞菌B1为材料,研究该菌株咔唑降解基因簇的组成和表达模式,阐释咔唑降解过程中关键酶的作用机理。通过分析不同菌株咔唑降解基因簇中基因的保守区,从菌株B1中成功克隆得到基因簇中carAa、carBa、carBb和carC基因片段。通过RT-PCR证实菌株B1的咔唑降解基因簇为诱导表达。通过同源克隆得到降解关键基因carB和编码两个亚基的carBa、carBb基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达。以2,3-二羟基联苯为底物,对CarB粗酶液进行了酶学性质分析。研究表明CarB蛋白催化最适pH和温度分别为7.4和30℃,Fe2+能显著提高酶的催化活力。     

谷关假单胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表达

低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值，然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多，对其基因多样性了解不够深入，因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源，通过基因组序列比对分析，从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测，表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度，同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp，预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质，氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃，在0 ℃相对酶活为60.2%，是一个低温脂肪酶；其最适pH为8.5，在pH 3.0~12.0时，仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后，PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB)；在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中，吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识，所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶，具有较好的应用前景。     

芳香烃化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因

以苯酚作为碳源从化工厂污水样品中富集筛选出降解能力较强的降解菌CP5,该菌能利用多种芳香烃化合物生长。16SrDNA序列系统发育分析表明,该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)。CP5可以在48h内将500mg/L的苯酚完全降解。从该菌株中扩增获得邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,该基因编码氨基酸序列与P.putida NCIB9816-4以及P.fluorescens PC20的双加氧酶具有最高同源度,均为99%。CP5菌株对芳香烃化合物的生物修复有较大的应用前景。     

烟草野火病菌hrpZ基因的克隆及蛋白的原核表达

采用PCR方法从烟草野火病病原菌Psta218中扩增harpin编码基因hrpZ,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组表达质粒pGEX-hrpZPsta。将重组质粒pGEX-hrpZPsta转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,得到重组大肠杆菌BL21/pGEX-hrpZPsta。经IPTG诱导得到14.7 kD的蛋白质。该蛋白质与其他已发现的harpins一样,能够使烟草等植物产生过敏性坏死反应、富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶K敏感。     

节杆菌AD26的分离鉴定及其与假单胞菌ADP对阿特拉津的联合降解

用富集培养法,从农药厂的工业废水中分离到高效降解除草剂阿特拉津的AD26菌株,通过16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为节杆菌(A rthrobacter sp.).降解基因的PCR分析表明,AD26含有阿特拉津降解基因trzN和atzBC,它能以阿特拉津为唯一氮源、蔗糖或柠檬酸钠为碳源生长,将阿特拉津降解成氰尿酸,降解速度快但降解不完全.假单胞菌(Pseudomonas sp.)ADP是Waekea实验室分离的阿特拉津降解菌株,含有阿特拉津降解基因atzABCDEF,能以阿特拉津为唯一氮源、柠檬酸钠为碳源(不能以蔗糖为碳源)生长.将阿特拉津降解成NH3,和CO2,降解完全但降解速度慢.在阿特拉津浓度为200 mg·L-1的无机盐培养基中进行的AD26和ADP混合培养表明,它们对阿特拉津的降解发生了互补和增强作用,两个菌株能在以阿特拉津为唯一氮源、蔗糖为碳源的培养基中生长,而且生长和降解速率都好于单个菌株,培养72 h后阿特拉津去除率达到99.9%,其中76.7%的阿特拉津被降解成NH3和CO2.这表明由节杆菌AD26和假单胞菌ADP组成的混合菌株在阿特拉津废水处理和污染土壤的生物修复中有很好的应用潜力.     

中华根瘤菌NP1亚硝酸盐还原酶基因的表达和酶学性质研究

[目的]研究中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)中亚硝酸盐还原酶基因(nir)的原核表达情况以及粗酶液的化学性质。[方法]构建该基因的原核表达载体p ET32a-nir,然后对重组蛋白质进行SDS-PAGE和Western blotting分析获得NIR酶在原核生物中的表达情况。通过测定粗酶液对亚硝酸盐降解情况研究相关酶学性质。[结果]SDS-PAGE检测结果表明,可溶性融合表达产物约为57 ku,其中亚硝酸盐还原酶大小约40 ku,与酶分子量的预估值一致;Western blotting证实该蛋白可与根据亚硝酸盐还原酶合成的多克隆抗体发生强阳性反应;酶学性质分析表明,亚硝酸盐还原酶活力约为247.15 U/m L,最适pH 6.5,最适反应温度37℃,该酶对Na Cl的耐受性为0.3 mol/L。[结论]亚硝酸盐还原酶蛋白重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,研究其酶学性质为NO_2~-生物清除提供了技术保障。     

棉花GhSRK2D基因的分子克隆及其功能分析

SnRK2类蛋白激酶在植物抵御非生物胁迫上起到非常重要的作用,可将其作为候选基因,通过转基因方式对作物进行耐旱性改良。 本研究利用RACE PCR技术从陆地棉分离到一个SnRK2同源基因GhSRK2D。生物信息学分析表明GhSRK2D属SnRK2sⅢ亚家族;GhSRK2D蛋白含有N 豆蔻酰化位点,跨膜结构域和5个核心的丝氨酸残基位点;另外, GhSRK2D蛋白的C末端保守结构也包含Osmotic Box、SnRK2 Box 和 ABA Box。 Southern杂交分析GhSRK2D基因在Y18生态型棉花基因组中含有两个拷贝;Real time PCR分析显示GhSRK2D在棉花不同组织器官中均有表达,在叶器官中表达量最高;且受ABA、高盐、高渗（甘露醇）及低温胁迫的诱导。这些结果预示了棉花GhSRK2D基因可能在非生物胁迫逆境下参与抗逆相关生理过程发挥重要作用。     

Cloning and Sequence Analysis of a Novel Cold-Adapted Lipase Gene from Strain Iip35 (Pseudomonas sp.)

A combination method of the usual-PCR and reverse-PCR for the cloning of a novel lipase gene directly from the total genomic DNA of strain lip35 (Pseudomonas sp.) is described, whereby a lipase gene (lip) was cloned directly from genomic DNA. The sequence data have been deposited in the GenBank and EMBL data bank with the accession number EU414288. The nucleotide sequence showed a major open reading frame encoding a 59-kDa protein of 566 amino acid residues, which contained a lipase consensus sequence GXSXG. The lipase lip had 74 and 70% homologies with the Upases of an uncultured bacterium and P.fluorescens PfO-1, respectively, but it did not show any overall homology with lipases from other origins. The functional lipase was obtained when the lip gene was expressed in Pichia pastoris GS115.