鸡大肠埃希氏菌菌毛表达、血凝谱及粘附特性研究

对６株具有不同致病性的鸡大肠埃希氏菌分离株体外菌毛的表达、对１３种不同红细胞血凝谱及血凝方式、对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）及在体内外对１日龄鸡气管组织的粘附特性进行了研究,结果表明,具有致病性的菌株,在体外适宜的条件下,能表达菌毛,非致病性菌株不表达。不同菌株的血凝谱及血凝方式具有差异,除中等致病性菌株ＭＧ３０e对大鼠红 细胞（ＲＢＣＦ）的凝集不能被Ｄ－甘露糖抑制,表现为抗甘露糖型血凝（ＭＲＨＡ）外,     

仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K88菌毛研究

通过玻片凝集试验、抗Ｄ－甘露糖微量血凝试验（ＭＲＭＨ）、离体细胞粘附试验、菌体蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和免疫印迹、质粒ＤＮ民泳等。分析了仔猪腹泻源大砀杆菌贵州株（４０９－１１）所产Ｋ８８菌毛的血凝谱、对肠上皮细胞粘附特性、菌毛蛋白单位分子量,并对其Ｋ８８基因进行了初步定位。结果表明：其所产Ｋ８８菌毛的血凝谱能凝集豚鼠和允许红细胞;能介导细菌粘会于仔猪离体肠上皮细胞,这种粘附作用     

小鼠肠炎沙门氏菌1和3型菌毛的粘附和致病作用

以红细胞凝集试验检测肠炎沙门氏菌的两个同源株证明分别有１和１．３型菌毛。该两菌株均能粘附于人颊上皮细胞和小鼠小肠粘膜上皮细胞，Ａ株较Ｖ株更容易发生粘附且粘附的菌数更多；在Ｄ－甘露糖存在的条件下，两菌株极易粘附，而经鞣酸预处理的上皮细胞对粘附人颊粘膜和小鼠小肠上皮细胞的抗Ｄ－甘露糖型的肠炎沙门氏菌Ａ株的粘附力下降，通过半数致死量测定表明，口服接种小鼠。Ａ株呈明显的毒力，而腹腔接种对Ｖ株的毒力则明显加     

禽病原性大肠杆菌I型菌毛单克隆抗体的研制及其对分离株的检测

从禽病原性大肠杆菌分离株ＴＫ３（Ｏ１）提取Ｉ型菌毛免疫ＢＡＩＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得４株能稳定分泌针对Ｉ型菌毛的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为ａＢ６、ｂＧ５、ｃＦ３和ｃＧ３。单克隆阻断甘露糖敏血凝试验,免疫胶体金和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验证明,单抗是Ｉ型菌毛特异的。这些单抗培养上清及腹水的ＥＬＩＳＡ效价为分别为１０＾－２～１０＾－３和１０＾－５～１０＾－６;腹水的平     

单抗对禽病原性大肠杆菌菌毛粘附抑制的研究

应用８株鸡病原性大肠杆菌研究了菌毛作为分型抗原和共粘附特性,以抗Ⅰ型菌毛单克隆抗体（单抗）ｂＧ５和甘露糖进行了抑制作用试验。在血凝试验中、单抗和甘露糖都能抑制血凝反应,说明这些株都属于Ⅰ型,通过以单抗或甘露糖的粘附抑制程序这些Ｅｃｏｌｉ株对鸡气管上皮都不能特异粘附。     

仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K_(88)菌毛研究

通过玻片凝集试验、抗D_甘露糖微量血凝试验 (MRMH)、离体细胞粘附试验、菌体蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)和免疫印迹、质粒DNA提取及电泳等 ,分析了仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株 (4 0 9_11)所产K88菌毛的血凝谱、对肠上皮细胞粘附特性、菌毛蛋白亚单位分子量 ,并对其K88基因进行了初步定位。结果表明 :其所产K88菌毛的血凝谱能凝集豚鼠和鸡红细胞 ;能介导细菌粘附于仔猪离体肠上皮细胞 ,这种粘附作用能被特异的K88抗血清阻断 ;菌毛蛋白亚单位的分子量为2 35 0 0Da;K88基因位于一个分子量为 85kb(5 4× 10 6Da)的大质粒上。当菌株于 18℃生长时 ,其K88菌毛不能表达     

大肠杆菌新菌毛抗原的研究：I.菌毛抗原及其血凝活性测定

Ｎｏ．１和Ｎｏ．２两株大肠肝菌产生一种新菌毛抗原（暂定各Ｆ１９８７），并有性菌毛形成；菌毛直径３．６３６ｎｍ，性菌毛直径４．２ｎｍ。抗Ｄ－甘露糖血凝试验（ＭＲＨＡ）表明：本菌毛抗原具有独特的血凝谱、能稳定地凝集人（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ）及貂的红血球，不凝集豚鼠、绵羊、山羊、马、牛、家兔、犬、貉子、小白鼠、鸽、鹌鹑等动物的红血球，戏猪红血球凝集不稳定；血凝作用仅能被相应菌毛因子血清所抑制，不被Ｋ８８、Ｋ     

鸡源大肠埃希氏菌某些生物学特性

对鸡源大肠埃希氏菌的某些生物学特性进行了研究,包括对１日龄鸡的致病性、溶血性、菌毛的表达、血凝性、对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）的粘附特性、体内外与鸡气管粘膜的粘附特征、质粒特征、全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及免疫转印等。结果表明,鸡源大肠埃希氏菌的溶血性、质粒特征、对ＣＥＦ的粘附特性与其致病性无关;菌毛与致病性有关,大部分菌株表达Ⅰ型菌毛;血凝能被Ｄ－甘露糖抑制,不同菌株血凝谱具有差异;体内外与气管粘膜的粘附特性与菌株致病性有关;在全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳中,相对分子质量约为４０７００的多肽仅存在于具有致病性的菌株中,经免疫转印证实,该多肽为致病性大肠埃希氏菌所特有     

禽大肠杆菌菌毛粘附特性的研究

用透射电镜观察了鸡大肠杆菌的３个致病菌株ＧＬ７（Ｏ５０）、ＨＢ５（Ｏ７８）及ＴＧ１８（Ｏ８８），发现在营养肉汤中于３７℃培养均表达菌毛，但在１８℃培养不表达菌毛，用３７℃培养的大肠杆菌对鸡气管粘膜做粘附试验，并用扫描电镜观察，发现它们对体内体外的鸡气管均可粘附，但１８℃培养的大肠杆菌均缺乏这种粘附作用。采用粘附抑制试验测定这３种菌株对体外鸡气管节段粘附的特异性，结果是抗这３种细菌菌毛的抗体能显著抑制各自相应的菌株对气管上皮的粘附；Ｏ７８株和Ｏ８８株对气管上皮的粘附作用可被甘露糖显著抑制，表明甘露糖对介导菌体对气管粘膜上皮细胞受体起重作用。用甘露糖不能抑制Ｏ５０菌株对气管上皮的粘着，表明该菌体的粘附作用不由甘露糖介导。用高碘酸钠处理能抑制所有菌株的粘附作用，再次表明细菌对气管上皮的粘附作用是由单糖介导的     

EDS－BH_（91）毒株血凝特性的研究

本试验主要从红细胞凝集谱、凝集解脱情况以及血凝性的影响因素几方面对本室分离的ＥＤＳ－ＢＨ９１毒株和ＥＤＳ－７６ＡＶ１２７毒株进行了比较系统的测定．试验结果表明：两毒株均能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，而且２４小时内无解脱现象；对兔红细胞呈可疑；对人、奶牛、绵羊、猪、小鼠、驴的红细胞不能凝集。血凝反应的最适温度为３７℃；最适红细胞浓度为１％；分别以ｐＨ７．４．浓度为０．ｏ１、０．０４、０．１、０．２Ｍ以及浓度为０．ｏ１Ｍ，ｐＨ为５．８、６．８、７．４和８．０的ＰＢＳ作为稀释液进行血凝试验．其血凝滴度无显著差异；０．０５～０．３％的甲醛溶液４℃下处理病毒７２小时以及反复冻融病毒５次，其处理前后的血凝性均无显著差异。８０℃１０分钟就可以破坏病毒血凝性，而５６℃作用１小时对病毒血凝性无影响。０．１２５～０．５００％的胰酶对血凝性的影响不明显；病毒对氯仿不敏感，属于无囊膜病毒。     

嗜温气单胞菌的鉴定及其外膜蛋白型研究

从病鳖、鳗鱼体内分离到2株嗜温气单胞菌(TAh-3、EAs-1),经形态学观察、生理生化特性等鉴定,确定TAh-3为嗜水气单胞菌,EAs-1为温和气单胞菌。动物感染试验结果表明,TAh-3株为致病性嗜水气单胞菌,对鲫鱼的致死率100%,EAs-1株为非致病性温和气单胞菌。SDS-PAGE电泳结果显示,TAh-3株外膜蛋白(OMPs)型由7条蛋白带组成,其中1条主带大小为40.0kDa;EAs-1株OMPs型由8条蛋白带组成,其中2条主带大小为38.0kDa、45.0kDa。     

Role of microfilaments and microtubules in the invasion of EPC cells by Aeromonas hydrophila

The influence of the cytoskeleton on the invasion of Aeromonas hydrophila strain AhJ-1, isolated from diseased fish, in the monolayer cell of epithelioma papillosum cells of carp (EPC) was evaluated by the recovery of gentamicin-resistant bacteria from Triton X-100 cell lysates. The depolymerization of microfilaments (MF) by cytochalasin B and D inhibited the uptake of A. hydrophila in a dose-dependent manner and that of microtubules (MT) by colchicines and nocodazole did not affect the invasion of A. hydrophila in EPC cells significantly. The invasion frequency decreased approximately 62% with the addition of 0.1 microg/ml cytochalasin D and nearly 86% by the addition of 5.0 microg/ml. Invasion decreased approximately 49% and 83% by addition of cytochalasin B in a concentration of 2.5 microg/ml and 10.0 microg/ml. Colchicine and nocodazole, inhibitors of MT formation appears to have little effect on the invasion of EPC cells by strain Ah J-1. Thus MF formation, but not MT formation seems to play an important role in the internalization of A. hydrophila J-1.     

三味中药水煎液单用及联用对鲫鱼免疫保护作用的研究

试验旨在探讨黄芪、地榆、五倍子三味中药水煎液单用及联用对鲫鱼的免疫保护作用.选取200尾鲫鱼,随机为5组,每组40尾.对照组鲫鱼饲喂基础饵料,试验组鲫鱼饲喂中药包被的饵料,黄芪、地榆、五倍子、联用浓度分别为2.500、2.500、1.250、0.625 g/mL,中药水煎液与饵料按1∶1比例混合,对鲫鱼进行定时定量饲喂...     

Carp erythrodermatitis (CE) due to an Aeromonas hydrophila infection. Casuistic and experimental results

In November 1987 high losses of carp (Cyprinus carpio) with the main symptom of skin ulcera were observed in a farm in northern Greece. Sixty-six isolates of bacteria, characterized mainly as Aeromonas hydrophila or Pseudomonas spp. could be isolated from lesions of diseased fish. Transmission experiments with these isolates using mirror carp showed that Aeromonas hydrophila strains induced identical clinical and pathological pictures after intra- or subcutaneous injection. Extracts of these Aeromonas hydrophila isolates, as well as a supernatant of culture bouillon were toxic for carp and mice, indicating the presence of endo- and exotoxins. The results prove that carp erythrodermatitis (CE) may be caused by different bacteria, mainly including A. hydrophila.     

绿色荧光蛋白基因标记嗜水气单胞菌的研究

嗜水气单胞菌广泛存在于水体环境中,可引起人和动物发病,尤其是引起鱼类的败血症。本文构建了pWSK129-gfp重组载体,并分别导入到嗜水气单胞菌强毒株J-1和无毒株4332中。在荧光显微镜下观察,菌体呈现绿色荧光。稳定性试验表明,Ah4332GFP传至70代,质粒稳定率可达100%;而AhJ-1GFP在同样条件下培养10代后,质粒的稳定率仅为15.1%。绿色荧光蛋白基因的导入为研究嗜水气单胞菌与宿主的相互关系提供了一种简单而直观的方法。     

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AopN蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株Ⅲ型分泌系统aopN基因序列,设计1对特异性引物,以J-1株的基因组为模板,PCR扩增得到aopN基因,连入pET-32a(+),转化至大肠杆菌表达,同时PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。aopN基因测序分析发现,片段长度为874 bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能检测到aopN基因的目的片段。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量为54.5ku,用兔抗J-1株的全菌抗血清进行Western blot分析表明,该蛋白具有较好的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子

用嗜水气单胞菌产生的细胞毒素—溶血素Ah-1,裂解羊泰勒虫感染的红细胞,通过Percoll密度梯度离心分离羊泰勒虫裂殖子,建立了一种自感染红细胞中分离泰勒虫裂殖子的快速方法。光学显微镜观察显示,所分离的羊泰勒虫裂殖子基本保留原有的正常形态,并从宿主细胞成分中游离。     

Contribution of AhyR to virulence of Aeromonas hydrophila J-1

Aeromonas hydrophila is a broad-host-range pathogen and its pathogenesis is multifactorial. A regulatory mechanism known as quorum sensing has been found to be involved in the regulation of virulence in many bacteria. In A. hydrophila the ahyR gene encodes LuxR-type response regulator. Here we describe the inactivation of the ahyR gene of A. hydrophila J-1 by the insertion of a DNA fragment containing a kanamycin resistance determinant and reintroduced by allelic exchange into the chromosome of A. hydrophila J-1 by means of the suicide plasmid pJP5603. Cytotoxic effects on EPC cells assay and LD(50) determinations in fish demonstrated that the ahyR mutant was highly attenuated relative to the wild-type strain. Compared with the parent strain, some characteristics, such as biochemical characters and outer membrane protein profiles, had changed. Some main virulent determinants could not be detected, including proteases, amylase, Dnase, hemolysin and S layer. This article confirmed the important function of AhyR in the pathogenesis of A. hydrophila J-1.