猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

牛病毒性腹泻病毒LAMP检测方法的建立与应用

针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5'UTR基因(GenBank登录号:AY278459.1)序列设计4条特异性环介导等温扩增 (LAMP) 引物,特异性识别靶基因序列上4个独立区域,采用LAMP技术,利用实时浊度仪实时检测LAMP 反应过程中所产生的焦磷酸镁白色沉淀,实时监测反应液浊度来判断反应结果,实现对扩增反应全过程的监控,建立BVDV的LAMP快速检测方法。通过实时浊度仪在恒温63 ℃下50 min完成检测,对方法的特异性、灵敏度、重复性进行了评价。结果显示,经优化该方法只检测BVDV阳性,特异性强;病毒10^-6倍稀释时仍能被检测到,比PCR方法灵敏度至少高100倍;重复性良好。LAMP实时浊度法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优势,为BVDV的临床检测提供了一种简单快速的试验手段。     

基于钙黄绿素显色的可视化LAMP检测猪流行性腹泻病毒的研究

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的NP基因设计1套环介导等温扩增(LAMP)引物,在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂代替传统的反应后添加SYBR Green Ⅰ染料,建立了基于钙黄绿素的可视化LAMP检测PEDV的方法。该方法能在65 ℃ 1 h内特异性扩增PEDV,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及大肠杆菌等均无交叉反应,检测下限为3.73 pg/μL,其结果可用肉眼判断,快捷方便。用该方法对龙岩学院动物医学研究所接诊的93份腹泻病例进行检测,结果表明,LAMP方法检测PEDV的阳性率为43.01%(40/93),高于普通PCR的检出率(38.7%,36/93)。本试验建立的可视化LAMP检测方法能用于PED诊断。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

摘要：猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属,是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMws）的主要病原。该病在世界范围内广泛流行,给我国养猪业造成一定的经济损失。目前针对PCV-2的检测技术还有提升的空间,因此本研究针对PCV-2Cap基因高度保守的区域作为靶序列设计引物,建立了一种可快速、灵敏、特异地检测PCV-2的LAMP检测方法。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

猪细小病毒LAMP-LFD检测方法的建立及初步应用

为了建立一种用于猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)的特异、灵敏、快速检测方法,试验根据GenBank发布的PPV基因序列保守区片段设计了一套带生物素标签的特异性引物和FITC探针,以pET28a-NS1重组质粒为阳性模板将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术与侧向流动层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)相结合,建立了PPV-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC-mAb比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性,并检测其早期临床应用效果。结果表明：建立的PPV-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为50 min;标记1 mL胶体金需要14μg FITC-mAb;该检测方法的最低检测限为1×10 copies/μL,比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR灵敏度高19倍;对猪伪狂犬病毒(PRV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪瘟病毒(CSFV)检测结果...     

猪细小病毒 LAMP检测方法的建立

猪细小病毒（PorcineParvoviru，PPV）属于细小病毒科细小病毒属，通常感染初产母猪后会发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病状。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行，中国PPV的感染也很广泛，因此本研究针对VP2基因作为靶序列设计引物，旨在建立一种可快速、灵敏、特异地检测PPV的LAMP检测方法。     

流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时间短,灵敏度比常规RT-PCR方法高,可检测出103TCID50/0.2mL JEV;特异性强,对猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等常见猪病毒均无交叉反应。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测流行性JEV的方法。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

Establishment of Indirect ELISA Detection Method for Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D_{450 nm}≥0.289,as negative when D_{450 nm}≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future.     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D_{450 nm}≥ 0.289判为阳性,D_{450 nm}≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。     

Establishment and Application of Duplex RT-PCR Assay for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Pseudorabies Virus

In order to establish an assay for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and pseudorabies virus (PRV),two pairs of primers were designed basing on the M gene of PEDV and gE gene of PRV,respectively.The total RNA of standard PEDV and PRV strains were used as templates to establish the duplex RT-PCR assay.The specificity,sensitivity,repetition and clinic detection of the established assay were tested.The result revealed that the threshold of duplex RT-PCR was 10 TCID₅₀/mL of PEDV and PRV,and no products were amplified from the cell or the nucleic acid of other 7 kinds of pathogenic viral or bacterial microorganism.The detection results for 26 clinical suspicious PEDV or PRV infected pigs were consistent with the results tested by sequencing.This study suggested that the duplex RT-PCR method was highly specific,repeatable and sensitive,and was suitable for clinic rapid differential diagnosis of PEDV and PRV.     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪流行性腹泻焦磷酸测序检测方法的建立

本研究旨在建立一种基于RT-PCR的焦磷酸测序方法,以便对猪流行性腹泻(PED)进行高效准确地检测。利用PSQ Assay Design SW软件分析了猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因的保守区域,设计了一对扩增引物及一条测序引物,建立了PEDV N蛋白基因的焦磷酸测序检测方法。实验结果表明,该方法可以直接通过PSQ的序列结果直观地判定PEDV,大大提高了PEDV的检出率和准确性。该方法特异性强,不与其他猪源病毒发生交叉反应,最低核酸检测限为0.05 pg/μL。本研究所建立的焦磷酸测序方法灵敏度高、稳定性好,能从基因序列水平上精确鉴定PEDV,避免了假阳性结果的出现,对于PED的快速确诊具有重要意义。