采用四引物ARMS-PCR方法检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性

试验旨在快速有效地检测泌乳奶牛的二酰甘油转酰基酶1（diacylgycerol acyltransferase 1,DGAT1）乳脂量性状的优势等位基因K232A单核苷酸多态性,确定DGAT1基因型进而确定泌乳性状,为中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择提供技术支持。选取6头泌乳初期（3头为高乳产量牛,3头为低乳产量牛）中国北方荷斯坦奶牛为研究对象,提取乳腺组织基因组DNA,分别设计1对外引物和1对内引物,建立一种四引物ARMS-PCR体系快速检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性。结果发现,外引物扩增片段长度为512 bp,为PCR反应的阳性对照,基因型为232K扩增片段长度为369 bp,基因型为232A扩增片段长度为181 bp。PCR结果显示,6头牛的乳腺组织样本均由外部引物扩增出长度为512 bp的片段,泌乳期高乳产量奶牛和泌乳期低乳产量奶牛乳腺组织的特异性扩增片段长度均为181 bp。表明本研究选取的6头奶牛样本DGAT1基因K232A多态性均为232A型。提示该PCR鉴定方法能够快速有效地鉴定奶牛DGAT1基因型,可用于中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择。     

贵州荷斯坦奶牛甘油二酯酰基转移酶基因多态性及其与产奶性状的关联分析

甘油二酯酰基转移酶（diacylglycerol acyl-transferase 1,DGAT1）是控制甘油三脂合成的关键酶。近年来DGAT1基因被鉴定出来,被认为是奶牛乳脂率的一个重要功能候选基因。该研究以贵州荷斯坦奶牛为试验动物,利用奶牛DGAT1基因序列设计引物,以RCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）方法检测了奶牛DGAT1基因第8外显子的碱基突变。结果共检测到AA、AB和BB 3种基因型,基因型频率分别为0.5588、0.3824和0.0588,等位基因A和B的频率分别为0.7549和0.2451;该碱基突变对305 d校正产奶量和乳脂率的影响均达到显著水平（P<0.05）,乳蛋白率影响不显著（P>0.05）;多重比较结果表明,AA和AB型对305 d校正产奶量和乳脂率均显著高于BB型（P<0.05）。结果显示,DGAT1基因突变对贵州荷斯坦奶牛泌乳性状有较大的遗传效应,可用于其泌乳性状的分子标记辅助选择。     

莱芜猪DGAT1基因的多态性研究

二酰基甘油酰基转移酶1（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT1）是催化酰基化的辅酶A和二酰基甘油合成甘油三脂的关键限速酶。莱芜猪具有较强的脂肪沉积能力，可能与DGAT1基因的活性有关。本研究对莱芜猪DGAT1的外显子6～8共476bp的序列进行了克隆、测序（GenBank登录号：DQ289596）和多态性分析，分别在外显子6的第27bp位点和外显子8的第56bp位点检测到单核苷酸多态（SNP），均属于沉默突变。克隆了莱芜猪5’调控区737bp的序列，在-241bp（相对于起始密码子ATG）发现单个碱基的插入，该多态性位点与莱芜猪脂肪沉积的关系值得进一步探讨。     

中国荷斯坦牛DGAT2基因第4外显子与产奶性状的关联分析

本试验以宁夏地区8个公牛家系的各8头女儿共计64头中国荷斯坦母牛为研究对象．利用AB13730测序仪对DGAT2基因Exon4进行了基因型检测后发现三个突变位点474bp（C／G）、48lbp（G／A）、621bp（C／T）,各个位点发现有两种基因型,分别为CC型、GC型,GG型、GA型,CC型和CT型,基因型频率分别为0．484、0．516,0．687、0．313,0．484和0．516。通过SAS软件（8．02）对4个产奶性状与DGAT2基因Exon4的关联分析表明．474bp（C／G）CG型305d产奶量和乳脂率显著高于CC型（P〈0．05）,乳蛋白率、体细胞数影响不显著（P〉0．05）;481bp（G／A）GA型305d产奶量显著高于GG型,与乳脂率、乳蛋白率、体细胞数无显著的相关性（P〉0．05）;621bp（C／T）CT型305d产奶量、乳蛋白率、体细胞数都显著高于CC型（P〈0．05）,乳脂率影响不显著（P〉O．05）。     

摩拉水牛二酰甘油酰基转移酶2基因的多态性检测

本研究旨在检测水牛二酰甘油酰基转移酶2（diacylglycerolacylt-ransferase,DGAT2）基因的单核苷酸多态性（SNP）,探究摩拉水牛多态性位点的群体遗传特征。以广西水牛研究所的57头摩拉水牛为材料,PCR扩增DGAT2基因的部分序列（外显子2及内含子2、3）,通过常规测序法检测其SNP,并运用遗传多样性分析软件（POPGENE）和SPSS软件对群体的多态性位点进行基因频率、基因型频率、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）及遗传杂合度（He）的检测。结果表明,在摩拉水牛DGAT2基因外显子2和内含子2、3上共发现了9个SNPs位点（IVS2.54 G > A、IVS2.158 A > G、EVS2.191 A > G、EVS2.228 A > G、IVS3.311 C > T、IVS3.444 A > G、IVS3.451 A > C、IVS3.466 C > T、IVS3.521 C > T）,其中EVS2.191 A > G位点的突变导致氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸,突变位点间存在一定程度的连锁遗传但接近连锁平衡状态。从基因频率上看,IVS2.158 A > G、EVS2.191 A > G、IVS3.311 C > T、IVS3.451 A > C、IVS3.466 C > T和IVS3.521 C > T 6个SNPs位点的两个等位基因频率有较大差异,提示等位基因频率较大的基因个体可能更适合生存。9个SNPs位点在摩拉水牛品种上多处于高度多态,杂合度在0.1744~0.4975之间,说明摩拉水牛群体中DGAT2基因遗传多态性丰富,具有较大的育种价值和性状改良潜力。     

奶牛SP1基因结构及对乳脂合成功能的初步分析

旨在探讨中国荷斯坦奶牛的特异性蛋白1（specificity protein,SP1）基因结构特征及其对奶牛乳脂合成的影响。根据NCBI已经公布的奶牛SP1基因序列（NM_001078027.1）,利用生物信息学分析其序列保守性、理化性质、蛋白亲水性、蛋白质结构及互作蛋白;采用PCR技术扩增并克隆SP1基因CDS序列。然后,选取6头健康的中国荷斯坦奶牛,分别取泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织,运用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测SP1基因在不同时期奶牛乳腺组织中的表达情况。分离并纯化泌乳期奶牛乳腺上皮细胞,通过SP1过表达及干扰检测其对乳脂合成的影响,分别进行3次独立试验。结果显示,SP1基因序列在不同物种间高度保守,与山羊相似度最高（98.94%）。奶牛SP1基因CDS区序列长2 361 bp,编码786个氨基酸,蛋白分子质量为80 902.17 u,理论等电点为6.94。平均疏水指数为-0.438,为不稳定的亲水性蛋白。SP1序列包含3个锌指结构,SP1蛋白二级结构以无规则卷曲（52.29%）为主。STRING蛋白互作分析结果显示,SP1与转录因子AP-1（JUN）、雌激素受体α（ERα）、MYC原癌基因蛋白（MYC）、TATA盒结合蛋白（TBP）等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,SP1的mRNA和蛋白在泌乳期的表达量显著高于干奶期（P<0.01）。在奶牛乳腺上皮细胞中过表达SP1显著增加细胞甘油三酯的合成（P<0.01）,而干扰SP1的表达,甘油三酯合成显著降低（P<0.01）。以上结果提示,SP1正向调控乳脂合成,分析SP1基因结构和功能为深入研究SP1对泌乳奶牛乳脂合成调控机制提供理论依据。     

Polymorphism of BRCA1 Gene and its Association with Mastitis Resistance in Holstein Dairy Cows

In order to study mutations of bovine breast cancer 1 (BRCA1) gene and its association with somatic cell count and somatic cell score in Holstein dairy cows in Beijing.SNPs of BRCA1 gene exon 13 and 14 were obtained by cloning,sequence alignment and searching for known mutations.In our research,25025 T>A of exon 9 and 46126 G>T of exon 13 in BRCA1 were detected by SNaPshot in Holstein dairy cows raised on the outskirts of Beijing city,as well as the association between SNPs and somatic cell count (SCC) or somatic cell score (SCS) were also analysed.The results showed that both 25025 T>A and 46126 G>T were detected in Holstein dairy cows.TT genotype at locus 25025 T>A and GT genotype at locus 46126 G>T were dominant genotypes,respectively.At locus 25025 T>A,least squares mean of SCC and SCS in individuals with AA genotype was significantly lower than that with TT and TA genotypes (P<0.05;P<0.01).Least squares mean of SCC in individuals with TT genotype was significantly lower than that with GG and GT genotypes (P<0.05),while SCS of different genotypes showed no difference at locus 46126 G>T (P>0.05).These results preliminarily indicated that the 25025 T>A and 46126 G>T mutations of BRCA1 gene could be used in molecular marker-assisted selection programs of mastitis resistance in Holstein dairy cows.     

BRCA1基因多态性及其与奶牛乳房炎抗性的相关性研究

为了研究BRCA1基因突变与荷斯坦奶牛体细胞数和体细胞评分的关系,试验通过对BRCA1基因外显子13、14进行克隆、序列比对和挖掘已有突变的方法确定该基因的多态位点,采用SNaPshot技术检测了BRCA1基因25025 T>A和46126 G>T突变位点在北京郊区荷斯坦奶牛群体中的分布,并对突变位点与体细胞数和体细胞评分进行了关联分析。结果表明,荷斯坦奶牛BRCA1基因2个位点均检测到3种基因型,其中25025 bp位点TT基因型为优势基因型,46126 bp位点GT基因型为优势基因型。25025 bp位点AA基因型个体体细胞数(P<0.05)和体细胞评分(P<0.01)都显著低于TT和TA基因型;46126 bp位点TT基因型个体体细胞数显著低于GG和GT基因型个体(P<0.05),但3种基因型个体体细胞评分无显著差异(P>0.05)。本研究结果初步表明,BRCA1基因25025和46126 bp位点可作为中国荷斯坦牛乳房炎抗性的标记辅助选择。     

乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1、MAN1A1基因多态性与其生长性状的关联分析

试验旨在探究甘油二酯酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）基因g.13504098 C>T位点、核受体辅抑制子1（nuclear receptor subfamily 6 group A member 1,NR6A1）基因g.11204707 A>C位点和α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase,MAN1A1）基因g.18795097 C>T位点的多态性与乌珠穆沁羊生长性状之间的关系,为高产乌珠穆沁羊分子选育提供新的遗传标记。运用Sequenom MassARRAY^®SNP技术对乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1和MAN1A1基因的3个多态位点g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T进行检测,同时利用线性混合模型分析基因型与其4、6月龄生长性状的关联性。结果显示,在这3个位点中均检测到3种基因型,具体为：g.13504098 C>T位点的基因型为：CC、CT和TT,优势基因型为CC （0.49）,优势等位基因为C （0.70）;g.11204707 A>C位点的基因型为：AA、CA和CC,优势基因型为AA （0.54）,优势等位基因为A （0.73）;g.18795097 C>T位点的基因型为：CC、TC和TT,优势基因型为TC （0.51）,优势等位基因为C （0.55）。卡方检验显示,g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T位点在乌珠穆沁羊群体中均处于哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态（P>0.05）。群体遗传学分析表明,这3个位点在乌珠穆沁羊种群中属于中度多态性（0.25<PIC<0.50）。关联分析结果显示,g.13504098 C>T位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体重、体高、胸围、管围及6月龄的胸宽均呈极显著相关（P<0.01）;g.11204707 A>C位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体高、体斜长及4月龄的体重、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与6月龄的体重、管围均呈显著相关（P<0.05）;g.18795097 C>T位点与乌珠穆沁羊4月龄的体高、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与4月龄的体重、胸围以及6月龄的胸宽均呈显著相关（P<0.05）。综上所述,DGAT1基因g.13504098 C>T、NR6A1基因g.11204707 A>C和MAN1A1基因g.18795097 C>T位点多态性与乌珠穆沁羊群体部分生长性状具有显著的关联性,可以作为乌珠穆沁羊遗传选育的候选分子标记。     

中国荷斯坦牛DGAT1基因与产奶性状关联分析

以北京地区来自17个公牛家系的1222头中国荷斯坦母牛为试验材料,采用PCR—RFLP技术对DGAT1基因进行了遗传多态性分析,共检测到KK、KA和AA3种基因型,频率分别为0．1432、0．6097和0．2471;采用混合动物模型对数据进行拟合,通过SAS（8．02）软件对5个产奶性状与DGAT1基因的关联程度进行了统计分析。结果表明,DGAT1不同基因型间的305d产奶量、乳脂量、乳蛋白量差异极显著（P〈0．01）;多重比较结果显示：AA基因型的305d产奶量和乳蛋白量显著高于KK基因型（P〈0．01）,其乳脂量显著低于KK基因型（P〈0．01）。结果提示DGAT1基因对奶牛产奶性状具有较大遗传效应,可以用于中国荷斯坦牛产奶性状的分子标记辅助选择。     

荷斯坦牛二酰基甘油酰基转移酶1基因外显子8的单核苷酸多态性位点对蛋白质结构和功能的影响及其进化分析

为了检测荷斯坦牛二酰基甘油酰基转移酶1(diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)基因外显子8的单核苷酸多态性(SNPs)位点,预测分析碱基突变对蛋白质结构和功能的影响,并讨论不同物种间DGAT1的进化关系。本研究利用PCR-SSCP综合测序方法检测DGAT1基因外显子8的SNPs位点,用生物信息学方法分析DGAT1蛋白的基本性质和结构功能,并分析不同物种间DGAT1氨基酸同源性及构建其进化树。PCR-SSCP分析结果显示,DGAT1基因外显子8存在1个双突变位点,即M694和M695;蛋白质结构和功能预测结果显示,该双突变不影响蛋白质的理化性质和结构,但能引起蛋白质功能域组成发生改变;进化分析结果显示,荷斯坦牛DGAT1氨基酸序列与绵羊同源性最高(99.1%),与黑猩猩同源性最低(65.3%)。     

德宏奶水牛DGAT1基因多态性及其与产奶性状的相关性分析

探讨德宏奶水牛（摩拉水牛×德宏水牛）DGAT1基因多态性与产奶性状的关系,以期为德宏奶水牛产奶性状标记辅助选择侯选基因的选择提供理论依据。以81头泌乳的德宏奶水牛为研究对象,利用PCR—SSCP方法结合候选基因直接测序法检测DGAT1基因第8外显子及第8内含子区的多态性,并采用最小二乘法分析DGAT1基因多态位点对产奶量、乳脂率及乳蛋白率的影响。结果在德宏奶水牛群体中共检测到CTGG,CCGG和CCGT三种基因型,测序结果显示,在检测的群体中未发现K232A位点的突变,而在DGAT1基因第8内含子的第14位检测到C→T突变,第35位检测到G→T突变。多重比较表明,CCGT基因型对德宏奶水牛的乳脂率有显著影响（P〈0．05）。     

鸡Nramp1基因第9外显子的单核苷酸序列多态性分析

以文昌鸡、安卡鸡及藏鸡为试验动物,利用PCR-SSCP方法检测Nramp1基因部分区域的单核苷酸多态性(SNP)。结果发现,该区域存在2个突变,分别为C315G、C357T;共出现4种基因型,分别为GG、GT、TT及AA型,在文昌鸡和藏鸡群体内,T为优势等位基因,而安卡鸡中G为优势等位基因。3个群体该座位均处于哈代-温伯格平衡(PO.05),且3个群体间基因型分布无显著差异(P0.05)。     

河北地区中国荷斯坦牛DGAT1基因多态性与泌乳性状遗传效应分析

本研究以河北地区870头中国荷斯坦牛为试验材料,采用PCR-RFLP法对DGAT1基因K232A位点进行了遗传多态性分析,并利用混合动物模型分析了DGAT1基因K232A位点突变对乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、305d产奶量5个泌乳性状的影响。结果共检测到KK、KA和AA 3种基因型,基因频率分别为0.0402、0.9276和0.0321;等位基因K和A的频率分别为0.5040和0.4960;该碱基突变对乳脂率的影响达到极显著水平(P<0.01),对30d产奶量的影响达到显著水平(P<0.05),对乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量的影响不显著(P>0.05);多重比较结果表明,KK基因型的乳脂率极显著高于KA和AA基因型(P<0.01);KA和AA基因型的305d产奶量显著高于KK基因型(P<0.05);AA和KA基因型的泌乳性状无显著差异(P>0.05)。结果显示,DGAT1基因突变对河北荷斯坦奶牛泌乳性状有较大的遗传效应,可用于泌乳性状的分子标记辅助选择。     

中国不同牛种DGAT1基因遗传多样性及经济性状关联分析研究进展

乙酰辅酯A∶二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)是甘油三脂合成过程中唯一的关键酶,对动物机体脂肪代谢、沉积起重要作用,已成为研究奶牛泌乳性状和肉牛主要经济性状的重要候选基因之一。近年来,随着相关研究的不断深入,研究者普遍认为DGAT1基因对奶牛的产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳脂肪酸及空怀天数、输精次数、初配年龄等繁殖性状均有显著影响,且与肉牛体脂也存在相关性。作者主要介绍了DGAT1基因的遗传多态性及其与经济性状关联分析在中国各地区不同品种奶牛、肉牛、水牛和牦牛上的研究进展,指出该基因对奶牛的产奶性能及肉牛的肉质性状、生长性状具有重要的调控作用。但由于环境条件、品种及选育背景等因素影响,DGAT1基因遗传多态性对不同地区不同牛群体的经济性状影响不尽相同。因此,要将DGAT1基因实际应用在品种选育工作中还需明确该基因对研究群体的具体遗传效应,并结合其他候选基因进行综合分析。     

广灵驴DGAT2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）基因进行克隆,生物信息学分析和检测其在不同组织中的表达情况,为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳脂率等方面的作用机制提供理论参考。根据GenBank上公布的马（登录号：XM_023645689.1）、双峰驼（登录号：XM_010973154.1）、绵羊（登录号：XM_027979550.1）等物种的DGAT2基因mRNA序列,利用Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物,应用RT-PCR法扩增DGAT2基因序列,用生物信息学方法分析DGAT2基因编码序列,用实时荧光定量PCR技术检测DGAT2基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、肌间脂肪、皮下脂肪组织中的表达。结果显示,广灵驴DGAT2基因CDS序列1 086 bp,编码361个氨基酸,提交到GenBank,获得登录号：MT993643,其编码序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的同源性分别为99.0%、92.0%、93.5%、92.0%、92.7%、85.3%、84.1%。系统进化树分析表明,驴与马的亲缘关系最近,和小鼠的关系最远。DGAT2蛋白分子质量40.96 ku,脂肪系数92.85,等电点9.16,是一种具有跨膜区的稳定碱性疏水蛋白。DGAT2蛋白有28个磷酸化修饰位点,2个糖基化修饰位点,没有信号肽,主要定位在内质网,α-螺旋（39.89%）和无规则卷曲（36.01%）是主要的二级结构。DGAT2基因在检测的8个组织中都有表达,其中皮下脂肪中的表达量显著高于其余组织（P<0.05）,其次是心脏、肝脏和肾脏,背最长肌中的表达量最低。本试验结果为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳品质性状的作用奠定基础。     

鸡GPC1基因外显子8的SNPs与部分免疫性状的相关性分析

采用PCR-SSCP对12个不同鸡种glypican-1(GPC1)基因外显子8的单核苷酸多态性进行检测,同时检测如皋鸡、安卡鸡和文昌鸡3个鸡种56日龄的5个免疫性状,进一步分析SNP位点与免疫性状的关系。结果表明:12个鸡种中均出现3种带型,存在g.155 C>A错义突变,引起苏氨酸突变为精氨酸。12个鸡种群中,AA、AB和BB基因型平均频率分别为0.259、0.545和0.211;平均观察杂合度为0.466,平均Shannon信息指数为0.671。除乌骨鸡、大骨鸡偏离了Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05),其余群体均处平衡状态。基于该位点构建的UPGMA聚类图将12个鸡种分为3大类,反映了12个鸡种在抗性方面存在的差异。经过关联分析,如皋、安卡鸡中AB型个体的IL-1浓度、H/L值与BB型存在显著差异,与AA型差异不显著;在其他免疫性状中各基因型之间均无显著差异。安卡鸡的一般抗性总体低于如皋鸡和文昌鸡。     

荷斯坦奶牛酮病对抗氧化系统影响的研究

为了探讨酮病对抗氧化系统的影响 ,以荷斯坦奶牛为实验动物 ,应用酮粉法和改良式水杨醛比色法随机检测结果 ,一组为 1 0头阳性牛 ,另一组为 1 0头对照牛。应用DTNB显色法测定血清中GSH Px活力 ,应用黄嘌呤氧化法测定血清中T SOD活力 ,应用硫代巴比妥酸法测定血清中MDA含量。结果表明 ,酮病奶牛血清中GSH Px活力极显著降低 (P <0 .0 1 )、T SOD活力显著降低 (P<0 .0 5) ,血清中MDA含量显著增高 (P <0 .0 5)。因此酮病影响奶牛抗氧化系统 ,这一结论对揭示奶牛酮病的发生机理具有重要的意义     

奶牛隐性乳房炎的细菌学检测

对贵州省某奶牛场采集的80份奶样进行了病原菌的分离培养及生化鉴定,结果有74份奶样长出细菌,细菌检出率为92.50％;共分离到143株细菌,其中葡萄球菌和链球菌为主要病原菌,所占比例为87.41％(125/143).     

陕西地区荷斯坦牛Mx1基因外显子多态性分析

牛Mx1基因位于1号染色体上,含有14个外显子,编码648个氨基酸。研究以346头陕西地区荷斯坦牛为研究对象,根据GenBank所提供的牛Mx1基因序列,设计15对引物,采用混合DNA池扩增测序和PCR-RFLP的方法对牛Mx1基因的14个外显子进行多态性分析。结果表明,4个SNPs,分别位于外显子3（g.843330T〉C,g.843411A〉G）、外显子4（g.844048C〉T）和外显子7（g.851325T〉C）。其中,外显子4（g.844048C〉T）为同义突变;外显子3（g.843330T〉C,g.843411A〉G）两个位点的突变分别导致了异亮氨酸（Ile）向苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）向精氨酸（Arg）的突变;外显子7（g.851325T〉C）位点的突变导致亮氨酸（Leu）变为脯氨酸（Pro）。4个SNPs位点都存在三种基因型,但纯合子的突变频率较低。4个SNPs位点共构建了11种单倍型,其中以H6为最主要的单倍型。结果显示,陕西地区荷斯坦牛Mx1基因存在较丰富的多态性,这将为Mx1基因结构和功能的研究以及将来在育种实践中的应用提供基础资料。