小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

Secretory Expression of DTMUV E Gene in Insect Cells and Study on its Immunogenicity and Protective Efficacy

Duck Tembusu virus (DTMUV) was newly emerged which caused severe egg-drop syndrome in duck.Here,we constructed the recombinant baculovirus by honeybee melittin signal peptide (Mels) which expressed E protein of DTMUV JSXZ strain,and its immunogenicity and protective efficacy were investigated in duck infection model.Western blotting and indirect immunofluorescence assay (IFA) showed E protein was effectively secretory expressed in supernatant of Sf9 insect cells.Indirect ELISA result showed E protein could induce high levels of anti-E IgG in the sera.MTT result showed that E protein could stimulate the proliferation of T lymphocytes.Moreover,the protection rates were 80% in 0.3 mL group and 100% in both 0.6 mL and 0.8 mL groups,respectively,whereas,all ducks in PBS control group showed the typical clinical signs with 3 died post challenge.These results laid a foundation for the study of DTMUV subunit vaccine.     

鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性与保护性研究

鸭坦布苏病毒(DTMUV)为新出现的病毒,主要引起鸭产蛋量急剧下降。本研究通过杆状病毒表达系统,利用蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,Mels)构建分泌表达DTMUV JSXZ株E蛋白的重组杆状病毒,将其感染Sf9昆虫细胞,从而分泌表达DTMUV E蛋白,并对该表达E蛋白的免疫原性和保护效果进行了研究。经Western blotting、IFA试验证明E蛋白可以在Sf9昆虫细胞培养上清中分泌表达;通过免疫雏鸭试验、间接ELISA结果证明E蛋白可以诱导产生高水平的IgG血清抗体;MTT试验结果显示E蛋白能刺激T 淋巴细胞增殖;攻毒保护试验结果显示0.3 mL组免疫保护率为80%,0.6 mL组和0.8 mL组保护率均为100%,而PBS对照组雏鸭均表现为典型的DTMUV感染症状,其中3只死亡。上述研究结果为DTMUV亚单位疫苗的研究奠定基础。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

Expression and Identification of F Gene of Duck Newcastle Disease Virus in Insect Cells

In order to express the F protein of duck Newcastle disease virus (NDV) in insect cells,one pair of specific primers was designed according to the published genome sequences of duck NDV to amplify F gene by PCR,the amplified fragment was cloned into baculovirus expression vector pFastBac1.Then the recombinant vector pFastBac-F was transformed into E.coli DH10Bac competent cells,and the positive recombinant bacmid rBacmid-F was screened according to the resistance and blue-white plague screening.rBacmid-F was transfected into Sf9 insect cells by liposome,once the cytopathic effect was found,the rBac-F could be aquired.The results of Western blotting and indirect immunofluorescence test showed that the recombinant proteins could be recognized by positive serum,indicating that the protein had good reactiongenicity.These results suggested that F protein of duck NDV had been successfully expressed in insect cells,which laid the foundation for the prevention and control of duck Newcastle disease.     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of Hemagglutinin-related Outer Membrane Protein from F.necrophorum

In order to analyze the immunogenicity of 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum,specific primers were designed to amplify the 3 truncated overlapping gene fragments covering the whole open reading frame (ORF) based on the result of antigenic epitope analysis.The gene fragments were ligated into the prokaryotic expression vector to construct pET-28a-p1,pET-32a-p2 and pET-32a-p3,respectively.Then recombinant plasmid was induced expression in E.coli.The SDS-PAGE results showed that the expression of recombinant proteins P1,P2 and P3,molecular mass of the expressed proteins were about 48,59 and 62 ku,respectively.Western blotting indicated that the recombinant proteins could be recognized by antiserum against F.necrophorum from mouse.Humoral immunity response against recombinant proteins was detected in the immunized rabbits.Altogether,these findings suggested that 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum had good immunogenicity,and this study provided a reference for further research on genetic engineering subunit vaccine of F.necrophorum.     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定.采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3) tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,进行IPTG诱导表达.利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力.结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1140、897、666 bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44 ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应.rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20％和40％,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性.结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分.     

Expression and Identification of F Protein of Peste Des Petits Ruminants Virus Strain Tibet 07 in Insect Cells

In order to obtain purified peste des petits ruminants virus F protein, the F gene of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07 was cloned into transfer vector pFastBac/CT-TOPO, plasmid pFastBacCT-PPRV-F was then transformed into DH10Bac complement cells. The recombinant bacmid DNA was isolated and transfected into sf9 insect cells to express F protein. The expressed F protein was identified by using SDS-PAGE, Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The recombinant F protein was successfully expressed in insect cells with a relative molecular of 59 ku.The sf9 cells infected by Bacmid-PPRV-F can reacted with positive serum of peste des petits ruminants.Using the Bac-to-Bac baculovirus expression system expressed the F protein of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07.This work provides basis for development of rapid test for detection of peste des petits ruminants antibody.     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.     

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析

旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV) E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达,收集细胞培养上清,进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化,Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性,利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL^-1;Western blot结果显示,利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带;新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平达到1∶1 024 000;IFA试验结果显示,该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达,进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。     

虎源FPV主要抗原表位区基因的原核表达及免疫原性分析

为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。     

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

Expression and Immunogenicity Analysis of Porcine Pseudorabies Virus gB Protein

In order to study the expression and immunogenicity of porcine pseudorabies virus (PRV) gB protein,the specific primers were designed with the template of PRV preserved in the laboratory, and the 612 bp conserved gene fragments were amplified and sequenced, then it was cloned into the expression vector pET-28a and transformed into E.coli BL21 (DE3), the target protein was obtained after induced expression and purification.Western blotting was performed to analyse its immunogenicity. The results showed that gB protein was 30 ku, which mainly expressed in the form of inclusion body, and the concentration of the protein was 106 μg/mL, with well reactogenicity. 13 PRV positive serum and 16 negative serum in the samples were detected using ELISA Kit on sale, using positive serum, the PRV antibody detection method was initially established with the PRV gB protein as antigen package.     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白表达及免疫原性分析

本试验旨在研究猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV） gB蛋白的表达并分析其免疫原性,以PRV病毒液为模板,设计特异性引物,扩增大小为612 bp的保守片段并测序,将其克隆到表达载体pET-28a中,转化表达菌BL21（DE3）,经诱导表达、纯化得到目的蛋白,进行Western blotting分析验证并分析免疫原性。结果表明,表达的gB蛋白大小为30 ku,主要以包涵体形式存在,复性后浓度为106 μg/mL,且具有良好的反应原性。应用市售试剂盒检测到样品中含13份PRV阳性血清和16份阴性血清,利用检出的阳性血清,初步可建立以PRV gB蛋白为包被抗原的PRV抗体ELISA检测方法。     

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR将增得到pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67-A中，构建重组质粒pGP67pGH，并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV-OCC)基因组DNA共转染Sf9细胞，构建出重组病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OC^-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果表明，细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为22kDa的猪生长激素特异性反应带，且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些，薄层扫描仪扫描估测可知，重组pGH分别占细胞可溶蛋白的8．98％和培养液上清总蛋白的3.61%。将表达96h的培养液上清浓缩液进行N－糖基化分析，结果显示重组pGH无N－糖基化加工修饰。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,重组蛋白P48大小约为66 ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。