伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达与鉴定

为获得伽氏疏螺旋体尚志株（B. garinii SZ）的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a（+）,并转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3）,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和纯化,然后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物;Western blotting分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应,获得的多克隆抗体也可识别天然蛋白。本试验成功表达了B. garinii SZ株P66蛋白,并制备了多克隆抗体,为后续B. garinii SZ株P66蛋白的功能研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列（登录号：NC_001659.2）设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1：128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在获得重组伪狂犬病病毒（PRV）gE蛋白及其多克隆抗体。利用PCR方法从PRV感染猪的肺脏、脑和扁桃体混合组织中扩增PRV gE基因,连接至克隆载体pMD18-T（pMD-gE）后进行测序与进化树分析。以pMD-gE为模板,利用PCR方法扩增其膜外结构域部分基因（gE-outside）,将其连接至原核表达载体pET-30a（+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-gE-outside。将重组质粒pET-gE-outside转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行表达产物的分析与鉴定。经亲和层析技术纯化重组PRV gE蛋白并免疫小鼠,通过间接ELISA和Western blotting分别进行三免3周血清中鼠抗PRV gE多克隆抗体效价的测定和鉴定。PCR和测序结果表明,本研究成功克隆了PRV gE基因,与国内2011年以后流行毒株属于相同分支。SDS-PAGE和Western blotting结果证实,PRV gE-outside基因在原核表达系统获得正确表达,分子质量约为55 ku,且可与猪抗PRV多克隆抗体发生免疫反应。经亲和层析纯化的gE-outside蛋白浓度为1.23 mg/mL。将其免疫小鼠,三免3周的小鼠血清中鼠抗PRV gE-outside多克隆抗体效价为1：204 800,并可与gE-outside蛋白发生免疫反应。综上,本研究制备了重组PRV gE蛋白和鼠抗PRV gE蛋白多克隆抗体,可为PRV感染机制研究及建立快速、高效免疫学检测技术提供技术指导和材料。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

牛乳源性金黄色葡萄球菌nEBPS蛋白表达鉴定及多克隆抗体制备

利用PCR方法扩增乳源致病性金黄色葡萄球菌nEBPS全基因，将其定向克隆至原核表达载体pET30a（＋）中，鉴定正确后，转化BL21表达菌，经IPTG诱导获得了以可溶性表达的重组蛋白。通过NiNTAPurificationSystem纯化重组蛋白，纯化蛋白质量浓度为2．16g／L。纯化蛋白经免疫印迹检测显示重组蛋白能够被牛源金黄色葡萄球菌阳性血清识别，具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，间接EI，1SA测定抗体效价为1：25600，凝集试验测定抗体效价为1：128。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。     

微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备

以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。     

肠炎沙门氏菌SEFA基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

为了给临床检测肠炎沙门氏菌的感染和血清学调查提供一种切实可行的方法,本研究根据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株CMCC(B)50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达载体pET22b+中,获得重组质粒pET-sefA,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表达,通过对菌体裂解上清液SDS-PAGE和western blot分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2ku的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化的rSEFA免疫小鼠所得高免血清以及标准株CMCC(B)50336感染小鼠后所获阳性血清,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,结果表明明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性。而基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。     

猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区（FcRn-CT）,构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Su...     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of African Swine Fever Virus Georgia 2007/1 Strain CD2v Protein

The study was aimed to express the EP402R gene of African swine fever virus (ASFV) Georgia 2007/1 strain via prokaryotic expression system,obtain the recombinant CD2v protein,and prepare polyclonal antibodies against the purified recombinant CD2v protein.After codon optimization,ASFV EP402R full-length gene was linked into pET-28a(+) expression vector to construct prokaryotic recombinant expression plasmid.After induction by 1 mmol/L IPTG at 16 ℃ for 12 h,the recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.The purified recombinant CD2v protein was used as immunogen to prepare mouse anti-CD2v polyclonal antibodies.The antibody titer was measured by indirect ELISA and the specificity was further analyzed by indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blotting.The results showed that ASFV EP402R gene was successfully cloned into pET-28a(+),and pET-28a-EP402R was obtained.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3) for expression,the recombinant protein was expressed mainly in the form of inclusion bodies,with molecular mass at about 47 ku,while some of the recombinant protein could also exist in a soluble form.Western blotting results showed that the purified protein had good immunoreactivity.The indirect ELISA result showed that the polyclonal antibodies had a high titer of 1:512 000,IFA and Western blotting results indicated that it could specifically recognize recombinant CD2v protein.These results confirmed the recombinant CD2v protein expressed via prokaryotic system had good immunogenicity,and the prepared polyclonal antibodies had high titer and specificity.This research provided technical support for further study of ASFV EP402R biological function,as well as its gene-deletion based vaccine development.     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRV σB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni²⁺柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1 100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204 800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRV σB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRV σB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号：MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31...     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC₀44959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。【结果】成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37℃6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1∶512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的...