耐热抗病辣椒种质“墨丽-M-Bs23/Me1R”的创制

辣椒细菌性疮痂病是湖北辣椒生产中主要病害之一,转育疮痂病抗病基因对辣椒抗病育种具有重要意义。本研究利用分子标记辅助选择结合杂交回交策略,将抗性基因Bs2和Bs3转育到核心亲本"墨丽-M"中,创制的辣椒种质"墨丽-M-Bs23/Me1R" 抗疮痂病,并具有"墨丽-M"的耐热和抗根结线虫的特征,植物学性状、配合力与核心亲本"墨丽-M"无明显差异。     

辣椒种质的抗性基因分子标记检测

利用已发表的与辣椒抗细菌性疮痂病Bs2、Bs3基因,抗根结线虫Me1、Me3/Me4基因,抗病毒病L4、Pvr4、Tsw基因,抗白粉病PMR1基因,抗疫病Phyto5.2位点连锁的分子标记,对209份辣椒种质进行分子标记检测。结果表明,209份辣椒种质中携带Bs2基因的种质1份、携带Bs3基因的种质4份;携带Me1基因连锁标记16880-1-V2片段的纯合位点种质48份、杂合位点种质12份,携带Me3/Me4基因连锁标记片段SCAR_B94的种质1份;携带抗TMV L~4/L~4基因型的纯合抗病材料11份,L~4/L~0基因型的杂合抗病材料1份;携带抗PVY Pvr4基因连锁标记CSO片段的纯合位点种质30份,杂合位点种质8份;携带抗TSWV Tsw位点连锁标记SCAC_(568)片段的种质4份;携带PMR1基因连锁标记ZL1_1826片段的种质3份;携带Phyto5.2位点连锁标记OpD04.717片段的种质38份,初步明确了209份供试辣椒种质的抗性基因型,为辣椒抗病育种提供材料选择依据。     

鄂西高山地区辣椒细菌性疮痂病生理小种鉴定

采用辣椒疮痂病菌鉴别寄主谱,于2011-2013年对鄂西高山辣椒种植区疮痂病菌生理小种进行分析鉴定。采集到的32份辣椒疮痂病菌菌株为生理小种P0和P2,其中生理小种P0为优势小种。在以后的育种工作中可以根据生理小种的鉴定结果合理选用抗源基因,培育抗疮痂病辣椒新品种。     

辣椒疮痂病抗性研究进展

辣椒疮痂病是辣椒生产中最为严重的细菌性病害之一,对辣椒的产量和品质影响较大。从病原菌的特征、分类、生理小种鉴定、抗疮痂病基因及其分子标记等几个方面总结了目前国内外的研究现状。     

利用多重PCR反应同时鉴定番茄Ty-3a基因和抗溃疡病QTL

番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病是两种分布广泛、危害严重的世界性病害,严重影响了番茄的产量,是国内外番茄抗病育种的重要目标。为了提高抗病育种的效率,研究建立了抗番茄黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和抗番茄溃疡病QTL的多重PCR反应体系。该体系利用同一PCR反应,对分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-3a基因和抗番茄溃疡病的一个QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记进行了扩增、筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Ty-3a基因紧密连锁的标记Ty-3F/Ty-3R为共显性标记,基因型为Ty-3a/Ty-3a的材料均产生630 bp的特异性片段,基因型为ty-3/ty-3的材料均产生320 bp的特异性条带,基因型为Ty-3a/ty-3的材料产生630 bp和320 bp的特异性片段;与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1连锁的标记TG318F/TG318R为显性标记,只有抗病材料产生580 bp的特异性片段,感病材料不产生特异性条带。经反复验证结果准确、稳定,可用于同一PCR反应体系中对番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和番茄溃疡病QTL的同时筛选鉴定。     

番茄抗TYLCV 基因新标记的开发及其在多抗聚合选择中的应用

根据已经克隆的番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）抗性基因Ty-1/Ty-3 和与基因Ty-4 紧密连锁的分子标记在抗感材料中的序列差异，开发出简单可靠的InDel 标记，建立了多重PCR 体系。采用分子标记辅助选择将TYLCV、斑点病、疮痂病和溃疡病中一个病害的多个抗性基因或不同病害的抗性基因聚合到一个材料中，培育出育种中间材料。     

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的双重SNP标记的开发

本试验旨在开发一种新的设计共显性SNP标记的方法,以提高SNP标记检验的效率,并将其成功应用于番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的SNP标记开发中,提高了种质资源鉴定和育种分离世代材料筛选的效率。通过对抗病基因Ty-1和等位感病基因ty-1的cDNA序列进行比对,挑选了两个稳定扩增的多元非同义突变位点,分别用来设计Ty-1和ty-1的SNP标记NL3和NL2,将两个标记进行混合得到双重SNP标记NL2-3。通过用NL2-3检验已知的抗病和感病番茄材料,验证了其多态性和稳定性。并用NL2-3对抗感病材料的F₃代杂交分离群体和普通自交系进行了Ty-1的筛选,并经过田间观察进一步验证了该标记的可靠性。此方法开发得到的双重SNP标记只需要进行一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分纯合抗、杂合抗、纯合感3种基因型,提高了育种选择的效率。     

国外引进辣椒种质的农艺性状及抗性评价

通过田间性状调查和人工接种鉴定,对从国外引进的53份辣椒种质进行了农艺性状和抗病性评价。结果表明,53份辣椒种质在调查的21个农艺性状中均具有丰富的遗传变异类型;通过表型性状的聚类分析能够将上述材料划分为两类,分别为栽培辣椒种和茸毛辣椒种;对53份辣椒材料抗疮痂病小种P0、抗疫病、抗黄瓜花叶病毒病(CMV)性状进行鉴定,共筛选出抗疫病材料1份、中抗疫病材料4份,中抗CMV辣椒材料6份。     

非洲辣椒种质资源鉴定与评价

对非洲引进的42份辣椒材料进行苗期和田间黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病和疮痂病的抗性鉴定,筛选出14份抗病性较好的种质资源。通过对其农艺性状综合评价,42份辣椒资源在生长势、坐果性、果形、果色等主要性状存在明显差异,筛选出3份抗病毒病、疮痂病及商品性好的辣椒优异种质资源。     

番茄3个抗疮痂病菌T3小种基因的等位性测定和序列分析

将分别携带抗番茄疮痂病菌Xanthomonas perforans T3小种基因Xv3、Rx4和RxLA1589的番茄材料Hawaii7981、PI128216和LA1589相互杂交,获得了包含535 ~ 1 655个单株的3个F2分离群体 Hawaii7981 × PI128216、Hawaii7981 × LA1589和PI128216 × LA1589。采用注射法对这3个F2群体的每个单株及亲本和感病对照OH88119进行抗T3小种鉴定,结果显示除OH88119外的所有单株对T3小种都具有过敏型抗性反应,表明Xv3、Rx4和RxLA1589为等位基因。根据Rx4基因的序列设计引物,从Hawaii7981、PI128216和LA1589中扩增该基因并测序,序列比对显示,来自于3个材料的Rx4位点编码区序列完全一致,表明这3个材料所携带的对番茄疮痂病菌T3小种的抗性由同一基因控制。     

利用RAPD技术快速鉴定辣椒杂交种纯度的研究

以新椒系列辣椒杂交种父母本和一代杂种为材料,采用液氮-SDS法提取辣椒基因组DNA,研究PCR反应的主要影响因子,建立适合辣椒杂交种纯度RAPD分析的PCR反应体系,从120个随机引物中筛选出1个能鉴定新椒10号杂种纯度的引物S1220,从7个随机引物中筛选出1个能鉴定新椒3号杂种纯度的引物S1213。     

番茄疮痂病抗性遗传研究和基因定位最新进展

 由黄单胞杆菌（Xanthomonas）引起的番茄疮痂病是严重影响番茄生产的一种细菌性病害。近年来，该病害病原菌小种的快速变化，特别是X. gardneri 的扩散，加速了人们对抗性遗传、基因定位和分子标记辅助育种的研究工作。迄今已经定位了3 个抗T3 小种的基因、5 个抗T3 小种的QTL 和3 个抗T4 小种的QTL，并对部分基因或QTL 进行了精细定位，建立了标记辅助选择体系，育成了抗T4 小种的品种。本文将就这些最新的研究进展进行总结，对现存问题进行分析，并对番茄疮痂病抗性遗传研究和育种应用前景进行探讨，以期为抗番茄疮痂病育种提供参考。     

辣椒花器官发育以丹基因和PDS基因VIGS载体的构建及鉴定

以辣椒恢复系121C为材料．采用RT—PCR技术从121C花药中克隆得到控制花器官发育B类基因朋丹的部分序列，片段长379bp，阳性对照八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoenedesaturae，PDS），片段长323bp，然后通过酶切分别连接pTRV2质粒，获得重组载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。利用PCR进行初步鉴定后进行序列测定。结果表明，辣椒尉丹基因和PDS基因已插入到pTRV2载体上，VIGS载体构建成功。该研究为下一步分析基因沉默和辣椒花器官的发育提供了试验基础。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

辣椒抗炭疽病主效基因的定位及标记开发

以高抗炭疽病的辣椒材料PBC932(Capsicum chinense)为父本,以感病辣椒材料77013(Capsicum annuum)为母本和回交亲本,获得包含220个和129个单株的BC_3S_1和BC_4S_1群体材料,通过对各群体进行尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)抗性鉴定和SNP(KASPar)分子标记分析,发现UN27353_1781标记与辣椒绿熟期炭疽病抗性基因AnR_(GO)5紧密连锁,遗传距离为2cM。进一步利用标记UN27353_1781对BC_4S_2群体124个单株进行分子标记分型,选择准确率达92.9%,表明该标记可有效用于辣椒抗炭疽病分子标记辅助育种。     

番茄抗病基因Sw-5和Ty-3a的多重PCR检测体系的建立

以含有斑萎病毒和黄化曲叶病毒抗病基因和感病基因的番茄为试材,采用多重PCR方法,建立番茄抗斑萎病毒Sw?5和抗番茄黄化曲叶病毒的Ty?3a基因同时扩增的体系,以期为番茄分子标记抗病育种提供更省时、省力、经济的方法。结果表明:多重PCR扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全一致,与Sw?5基因紧密连锁的SCAR标记,在抗病基因型中可扩增出574bp的条带,感病基因型中扩增出464bp的条带;与Ty?3a基因紧密连锁的SCAR标记,在抗病基因型中可扩增出630bp的条带,感病基因型中扩增出320bp的条带,多重PCR体系可在同一PCR反应体系中对2个抗病基因进行筛选鉴定及苗期早期辅助选育。     

辣椒RAPD反应体系建立及杂交种纯度鉴定研究

以豫椒系列品种父母本和杂交种为材料，采用液氮-SDS法提取辣椒基因组DNA，使用Bio-RAD-Mycy-cler型PCR仪和Bio-RAD1000凝胶扫描仪，研究PCR反应的主要影响因子，建立适合辣椒RAPD分析的PCR反应体系，从40个10bp的随机引物中筛选出1个能鉴定豫椒968杂种纯度的引物S149。     

中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒的研究

本研究的目的是获得抗病毒病的辣椒材料,为选育抗病毒病辣椒品种奠定基础。根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物,从中国商陆（Phytolacca acinosa）叶片基因组DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因（PacPAP1,构建该基因的植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化辣椒,对转基因植株进行分子检测、TMV及CMV的人工接种鉴定,接种25d后,统计发病情况。结果表明：克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP,大小为714 pb,与美洲商陆抗病毒蛋白基因（PamPAP）的同源性为99.7%;得到了PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株;接种TMV、CMV阴性对照植株都明显发病,转PacPAP1基因植株未出现症状,说明转PacPAP1辣椒植株可获得抗TMV和CMV材料。     

番茄抗黄化曲叶病ty-5基因的PCR快速检测

以番茄抗病材料CLN32120a-23(含ty-5基因)和感病材料Moneymaker(不含抗病基因)为试材,通过杂交、自交获得的F1、F2代,利用SSR分子标记技术筛选出了1个与抗病性状共分离的共显性SSR标记。结果表明:该标记在CLN32120a-23中可以扩增出550bp的条带,在Moneymaker中可以扩增出780bp的条带,在F1中可以扩增出上述2条条带,标记结果与田间鉴定基本一致,证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄抗黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁的共显性标记。对27份番茄材料进行检测,鉴定出有15份材料基因型为ty-5/ty-5,分子标记检测与田间检测结果吻合率达80%。该标记可用于番茄抗黄化曲叶病毒ty-5基因的PCR快速检测,同时为ty-5分子标记辅助选择育种的应用提供一定的参考依据。     

Cry2Aa2 和PamPAP 双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化

 为了获得既抗虫又抗病毒病，又对人体和环境安全的转基因辣椒（Capsicum annuum L．）材料，将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter 及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP 一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI 的多克隆位点上，构建双价表达载体，采用农杆菌介导法将其转入辣椒中，并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR 扩增和Southern 杂交检测，结果表明Cry2Aa2和PamPAP 已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR 分析，证实Cry2Aa2 和PamPAP 在T₀ 代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定：T₀ 代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒（CMV）和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。