大肠杆菌K1侵袭血脑屏障的研究进展

大肠杆菌K1株是引起新生儿败血症和脑膜炎的代表菌株,经血液循环进入大脑而致病。大肠杆菌K1黏附、侵袭脑微血管内皮细胞（BMECs）并穿越血脑屏障（BBB）的分子机制一直是众多学者研究探讨的热点。文章重点阐述致脑膜炎大肠杆菌K1穿越BBB的基因调控和信号介导通路,旨在了解致脑膜炎大肠杆菌感染的分子机理,为预防和治疗脑膜炎提供参考。     

阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠肠黏膜屏障的影响

作者旨在研究阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O1大鼠肠黏膜机械屏障、免疫屏障和化学屏障的影响。选用60只6～8周龄SD大鼠进行试验,分为空白对照组、未治疗组、环丙沙星组和阿如拉-7味散高(1.08g·kg^-1)、中(0.54g·kg^-1)、低(0.27g·kg^-1)剂量组,共6组,每组10只。试验结束时,计算其保护率,并采集小肠各段进行HE染色,测定小肠黏膜形态指标;同时采集血清和回肠组织,ELISA试剂盒法检测血清中的D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)含量以及回肠黏膜中的分泌型免疫球蛋白(sIgA)和肠三叶因子(ITF)含量。结果表明:(1)阿如拉-7味散中剂量对感染致病性E.coli O_1大鼠的保护率最好,为50%;且对小肠黏膜形态有一定的改善和修复作用,其效果与环丙沙星相当;(2)环丙沙星组与空白对照组相比D-乳酸含量无显著差异(P>0.05);阿如拉-7味散高、中剂量组DAO含量与空白对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)除阿如拉-7味散低剂量组外,其余各组与未治疗组相比回肠黏膜sIgA含量显著提高(P<0.05);未治疗组大鼠回肠黏膜ITF含量与其余各组相比显著降低(P<0.05)。结果提示,阿如拉-7味散对感染致病性E.coli O_1大鼠引起的肠黏膜损伤有一定的修复作用,其中中剂量(0.54g·kg^-1)效果最佳,与抗生素环丙沙星的修复效果相当。     

Advances on the Experimental Infectious Models of Avian Pathologenic Escherichia coli

Avian pathogenic Escherichia coli(APEC) is an important pathogen that causes localized and systemic infection in avian species of all ages.It is also an important reservoir or source of virulence genes of human extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC).In order to understand deeply the infection progresses,pathogenesis,host immune responses and genetic resistance mechanism of APEC,and evaluate the efficacy of drugs and vaccines,several experimental infection models were established to evaluate the virulence of APEC through different approaches.According to the different systems involved,it can be divided into respiratory system,vascular system,musculoskeletal system,dermatological system,reproductive system,gastrointestinal system and chicken embryo system.In addition,there are infection experiments in mice and rats,tissue culture cells and explants infection experiments in vitro.The author highlights the establishment,pathogenesis,host responses and application of the different APEC experimental infection models.     

禽致病性大肠杆菌实验感染模型研究进展

禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是导致不同日龄禽类局部和全身感染的重要病原菌,也是人肠外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC）毒力基因的重要储存宿主或来源。为深入理解APEC的感染过程、致病机理、宿主免疫应答及遗传抵抗机制、评估药物和疫苗防治效果,研究者通过不同途径建立了多种评估APEC毒力的实验感染模型。根据所涉及的系统不同可分为呼吸系统、脉管系统、肌肉系统、皮肤系统、生殖系统、消化系统及鸡胚系统等。此外,尚有小鼠与大鼠感染试验及组织培养细胞和外植块感染试验等。作者重点介绍了不同APEC实验感染模型的建立、致病机制、宿主应答及应用。     

产志贺毒素大肠杆菌流行病学及主要毒力因子研究进展

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC) 是一类能引起包括水样腹泻、出血性结肠炎、尿毒综合症等一系列人体疾病的人畜共患肠道致病菌,其感染在世界范围内包括中国都有过暴发流行。文章阐述了STEC O157血清型和非O157血清型的分布特征及流行趋势,同时还对该病的主要毒力因子进行了综述,以期为该病的防控提供科学依据。     

不同毒力基因型大肠杆菌的毒力测定

为确定不同毒力因子对大肠杆菌毒力的影响,选用7株不同毒力基因型(分别为Stx2e 、LEE 、LEE HPI 、Stx2e HPI 、F18 Stx2e 、F18 Stx2e LEE 和F18 Stx2e ST1 LT1 LEE )的猪源大肠杆菌为材料,以消化道为感染途径,测定了其对30日龄健康ICR小鼠的半数致死量(LD50)。结果表明,以上7株大肠杆菌的LD50分别为1.504×109,5.986×108,3.777×108,1.504×108,5.986×107,3.777×107cfu/mL和1.504×107cfu/mL;确定了不同毒力基因型的大肠杆菌之间存在毒力差异,其中S462234株(F18 Stx2e ST1 LT1 LEE )的毒力最强,S452623株(Stx2e )的毒力最弱,S462234株的毒力是S452623株的100倍。     

感染产肠毒素大肠杆菌的猪小肠上皮细胞microRNA表达谱分析

试验旨在探索产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）诱导的microRNA （miRNA）表达谱变化,为解析宿主miRNA在ETEC感染过程中的调控作用提供理论基础。利用Illumina 6000 Novoseq SE50测序平台分别对ETEC感染前后的IPEC-J2进行高通量测序,用Bowtie与参考基因组比对,用DESeq R Package进行miRNA差异性分析。通过miRanda和RNAhybid共同预测差异表达miRNA的靶基因,对差异表达miRNA靶基因进行GO功能和KEGG通路分析。随机选取5个miRNAs,对测序结果进行实时荧光定量PCR验证。结果显示,IPEC-J2在感染前后的sRNA文库经过滤分别得到12 889 260和11 203 056条clean reads。感染前后文库中,miRNA所占比例最高,分别为73.16%和54.10%;分别有97.98%和69.83%长度为18~40 nt的sRNA可比对到参考基因组,表明测序质控良好。长度在22~24 nt的序列大部分首位碱基偏向U,2~8位点出现频率最高的碱基分别为AGCUUAU。共发现311个已知miRNAs,128个新miRNAs。在2个文库中,长度为23 nt的miRNA序列占比最高,分别为41.42%和23.56%。感染后共筛选到140个差异表达miRNAs,其中74个表达上调,66个表达下调。GO分析表明,miRNA靶基因显著富集于代谢过程、正向调节代谢过程、细胞成分或生物合成、免疫系统、细胞内部分和细胞器等功能。KEGG分析表明,差异表达miRNA靶基因显著富集于赖氨酸降解、生产IgA的肠道免疫网络、NF-κB信号通路和T细胞受体信号通路等。实时荧光定量PCR验证结果表明,随机选取的5个miRNAs表达趋势与测序结果一致,表明测序准确可靠。综上所述,IPEC-J2的miRNAs参与了ETEC感染过程,为进一步揭示调控ETEC感染的关键miRNA及其作用机制提供科学依据。     

人成熟叠朊在大肠埃希菌中高效表达

以含有人叠朊编码基因Prnd的ORF的质粒HoPrnd-T为模板,PCR扩增出成熟叠朊编码基因片段homDpl,并将其插入原核表达载体pGEX-6P-1的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,构建出重组表达质粒pGEX-homDpl。将pGEX-homDpl电转化到宿主菌株BL21(DE3)中,以1.0 mmol/LIPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示人成熟叠朊被大肠埃希菌高效表达。     

嗜酸乳杆菌发酵中药对产肠毒素大肠杆菌K88所致腹泻的防治作用

本试验旨在研究嗜酸乳杆菌发酵中药对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88所致腹泻小鼠的影响。选取6~8周龄巴比西小鼠（BALB/c）100只,分为4组,分别为空白对照组（Ⅰ组）、大肠杆菌感染模型组（Ⅱ组）、中药发酵组（Ⅲ组）及中药水提组（Ⅳ组）,其中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组小鼠均用"抗生素+大肠杆菌"模式造模。Ⅰ、Ⅱ组饲喂不含任何药物的基础日粮,Ⅲ、Ⅳ组分别在基础日粮中添加10%中药发酵液、10%中药水提液。统计分析各组小鼠腹泻率、腹泻指数、免疫器官指数、肠道菌群及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量。结果显示,ETEC K88感染小鼠36 h后,与Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ组小鼠腹泻指数（P < 0.05）与腹泻率降低,且Ⅲ组腹泻指数显著低于Ⅳ组（P < 0.05）,Ⅲ、Ⅳ组盲肠内大肠杆菌数量较Ⅱ组降低,双歧杆菌及乳酸菌数量提高,且Ⅲ组效果更优;Ⅲ、Ⅳ组的免疫器官指数均高于Ⅰ和Ⅱ组,且与Ⅱ组相比,Ⅲ组的脾脏指数、胸腺指数及肝脏指数分别提高了48.37%、29.57%、36.88%,且差异均显著（P < 0.05）;Ⅲ、Ⅳ组IFN-γ/IL-4比值较Ⅱ组提高,且Ⅲ组高于Ⅳ组。综上所述,乳酸菌发酵中药液具有降低腹泻小鼠腹泻率及腹泻指数,提高免疫器官指数,维持肠道菌群平衡及快速消除体内炎症反应等作用,可为开发防制ETEC所致的仔猪腹泻产品提供参考。     

大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原提纯及抗血清制备

采用加热法和盐析法对大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原进行了提取、纯化,并通过SDS—PAGE凝胶电泳对提纯效果进行了检验。将纯化的纤毛抗原免疫家兔,制备了K88、K99、987P纤毛抗原抗血清,用琼脂扩散试验检测了抗血清的效价。结果表明,纯化的K88、K99、987P纤毛为高纯度的纤毛抗原,其分子量分别约为26、18、20kD。K88、K99、987P抗血清的琼扩效价依次为1：32、1：32、1：128,且特异性高。本研究为K88、K99、987P纤毛抗原定量检测及产纤毛大肠杆菌菌株的鉴定奠定了基础。     

产志贺毒素大肠杆菌的流行病学及致病因子的研究进展简

产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）是一类危害严重的食源性病原菌，能引起人类的严重疾病，如出血性结肠炎、溶血性尿毒症等，牛、羊等反刍动物是引起人类发病的主要宿主来源。作者总结了产志贺毒素大肠杆菌病的流行病学现状，就产志贺毒素大肠杆菌染色体和毒性质粒上的主要毒力因子的研究进展作一综述。     

仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

本研究以致泻性大肠杆菌(DEC)的4种毒力因子EAST1、LT、STa和STb为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,以建立仔猪DEC的多重PCR检测方法.该方法具有较好的特异性,只对DEC产生特异性条带,对非DEC及其他病菌则呈阴性.利用所建立的多重PCR方法对吉林省各猪场采集的样本进行检测,结果表明,在测定的猪场中...     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人IL-6cDNA引物.采用PCR法扩增出了成熟人IL-6基因片段,并在其5’端加入了一个Eeo RI部位和ATG,3’端加入了一个Bam HI部位和TAA.利用pBV220质粒构建成功了pBV220 IL-6表达载体.将该重组质粒导入E.coli DH5α中,经30℃扩增和42℃诱导,表达出了分子量为21000的预期蛋白.经SDS-PAGE分析与薄层扫描测定,重组IL-6的含量约占全菌体总蛋白的27％以上.菌体裂解液用7TD_1细胞测定,证明具有明显的IL-6活性.实验还对工程菌的IL-6表达动态和包涵体提取进行了研究,从而为工程菌发酵与IL-6纯化提供了工作基础.     

Study on the Virulence Gene Distribution and Genetic Evolution of Cattle Shiga Toxin-producing Escherichia coli Isolates

This study was aimed to understand the relationship of virulence gene distribution and genetic evolution between cattle originated Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and human originated enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157. This experiment collected 18 strains STEC in a dairy farm from Jiangsu province and 9 STEC reference strains (human, sheep, swine and avian), according to the method of U.S. Centers for Disease Prevention and Control Center (PulseNet), using the XbaⅠ enzyme digestion and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) analysis, virulence genes were detected in some STEC isolates. The virulence gene distribution of O157 from different origin was remarkably different. The cattle originated STEC O157 and the human originated EHEC O157:H7 (EDL933W) had the most similar virulence gene distribution. In contrast, virulence genes were lack in cattle STEC O18 and O26, even though the cattle STEC O18 and O26 had the similar genotype as human EHEC O157:H7 (EDL933W). PFGE of Xba Ⅰ digested chromosomal DNA from 27 isolates of STEC exhibited 22 profiles. In general,the Dice coefficients of different originated STEC ranged from 72% to 100%.Cattle STEC O157 had a high similarity with two strains of human originated EHEC O157, while a low similarity was demonstrated between cattle STEC O157 and STEC O157 of swine and avian. The Dice coefficients of the cattle STEC O157 and the two strains of human EHEC O157 ranged from 83% to 95%. The Dice coefficients of cattle STEC O26 (Ⅶ,Ⅷ) and the two strains of human EHEC O157 were more than 82%. Therefore, it was concluded that the cattle STEC O157 and human EHEC O157 had a closer relationship in terms of virulence gene distribution and in genetic evolution.     

基于猪小肠上皮细胞炎症模型分析产肠毒素大肠杆菌诱导的转录组表达变化

【目的】分析产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）炎症反应的主要宿主调控基因及相关分子通路,为进一步揭示ETEC感染引发炎症反应的作用机制提供理论依据。【方法】用感染复数（multiplicity of infection,MOI）为100的ETEC菌液感染IPEC-J2细胞,18 h后收集细胞上清,通过ELISA方法检测炎性因子白细胞介素1β（interleukin 1 β,IL-1β）的分泌水平。由Illumina PE150测序平台进行高通量转录组测序,通过edgeR v 3.12.1软件对测序结果进行差异表达分析,利用GOseq和KOBAS 2.0软件对得到的差异表达mRNA进行GO功能和KEGG通路富集分析,随机挑选5条差异表达mRNA,利用实时荧光定量PCR对其验证。【结果】试验成功建立了ETEC感染诱导的IPEC-J2细胞炎症模型。与对照组相比,炎症模型组共发现529条差异表达mRNA,其中236条表达上调,293条表达下调,包括HSP90AA1、CGNL1、CADPS2、EHBP1等免疫相关基因。GO功能分析表明,ETEC感染后差异表达mRNA显著富集于细胞组分和生物过程,包括细胞内成分（intracellular part）、细胞质（cytoplasm）、核成分（nuclear part）、胞内膜结合细胞器（intracellular membrance-bounded organelle）、膜结合细胞器（membrance-bounded orgabelle）及细胞进程（cellular process）等。KEGG通路分析表明,炎症模型中差异表达基因大多数被注释到疾病相关通路及Toll样受体信号通路、mTOR信号通路、细胞周期、黏附连接等免疫相关信号通路。利用实时荧光定量PCR验证随机挑选的5条差异表达mRNA,结果与测序报告中差异表达mRNA变化趋势一致,证明测序结果可信。【结论】HSP90AA1、CGNL1、CADPS2和EHBP1等基因可能在ETEC黏附IPEC-J2细胞并诱导炎症反应中发挥关键作用,并通过Toll样受体、mTOR等信号通路进行免疫调控。研究结果为进一步揭示ETEC感染诱导炎症反应的分子机制及相关调控网络提供参考依据。     

牛源产志贺毒素大肠杆菌分离株的毒力基因分布和遗传进化分析

为了探讨牛源产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）分离株在毒力基因分布和遗传进化方面与人源EHEC O157菌株之间的关系,本试验选择收集来自江苏某奶牛场的STEC菌株18株以及人源、羊源、猪源、禽源STEC参考菌株9株,参照美国疾病预防控制中心PulseNet推荐的方法,运用XbaⅠ酶进行酶切并完成脉冲肠凝胶电泳（PFGE）分型和聚类分析;同时对部分STEC菌株进行毒力基因检测。结果表明,经毒力基因检测,不同来源的O157菌株毒力基因分布不尽相同,其中牛源STEC O157与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）的基因排谱最为相近;牛源STEC O18和O26的基因排谱与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）类似,但存在部分基因的缺失。对27株不同来源的STEC分离株进行PFGE,产生了22种不同的酶切图谱。总体来看,不同来源的STEC Dice相似性系数在72%~100%之间。牛源O157分离株与猪源及禽源O157菌株的相似度偏低,而与两株人源O157分离株的相似度偏高,Dice相似性系数在83%~95%之间,牛源O26（克隆群Ⅶ、Ⅷ）与人源O157的相似性系数 > 82%。显然,从牛群中分离到的部分STEC菌株与人源EHEC O157具有较近的遗传进化关系。     

鸡源大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性分析

为探明泰州地区鸡源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)情况及耐药情况,对13株分离自泰州地区的鸡源大肠杆菌进行ESBLs检测,并采用微量肉汤稀释法测定不同药物对产ESBLs菌和非产ESBLs菌的最小抑菌浓度(MIC).结果显示,13株分离菌中有5株被确定为产ESBLs菌株,阳性率为38.5%.产ESBLs菌对β-内酰胺类抗菌药的耐药性极其严重,耐药率明显高于非产ESBLs菌,二者对氨苄西林的耐药率分别为100%和62.5%,对头孢噻呋的耐药率分别为100%和12.5%,对头孢曲松的耐药率分别为80%和20%,产ESBLs菌对其他抗菌药物的耐药率也明显高于非产ESBLs菌.氨苄西林与舒巴坦(2:1)联用与单用氨苄西林相比,对产ESBLs菌的MIC值降低至单用氨苄西林时的1/16~1/8,但对非产ESBLs菌的MIC值没有明显变化.氨苄西林与阿米卡星(1:1)联用与单用两者中的任何一种相比,对产ESBLs菌和非产ESBLs菌的MIC值均降低至单药时的1/16~1/2.结果表明,临床可选择β-内酰胺酶类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂的混合制剂来治疗产ESBLs鸡大肠杆菌的感染,也可尝试将不同种类、不同作用机理药物联合应用来治疗鸡大肠杆菌感染,尤其是耐药性鸡大肠杆菌感染.     

产肠毒素性大肠杆菌肠毒素的研究概况

本文分析了大肠杆菌耐热肠毒素 (heat-stable,ST)和不耐热肠毒素 (heat- labile,LT)生物学特性、分子水平机制及其应用价值。一方面着重讲述 LT作为粘膜免疫佐剂的研究前景 ,利用体外定点突变方法构建不同的突变株并且均具有不同程度的佐剂活性 ,是霍乱毒素 (Choleratoxin,CT)很有希望的替代品。另一方面讲述ETEC基因工程亚单位疫苗的研究概况。ETEC只有 LT、ST两类肠毒素 ,通过不同方式构建融合基因探讨对 ETEC性腹泻防治效果。目前 ,这两方面均卓有成效 ,但还有许多的难点需进一步的研究     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETECK99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm—T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET—K99-ST1,将其转入表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导,获得31ku的蛋白;Western—blotting结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应。     

土鸡屠宰过程中大肠杆菌毒力基因检测及耐药性分析

为了解土鸡屠宰过程中大肠杆菌污染、毒力基因携带及耐药情况,2018年9月-2019年1月在重庆万州、开州、巫溪、奉节4个区县的12个土鸡屠宰地点采集了319份样品,通过菌落形态及显微镜观察、生化鉴定、PCR、药敏试验等方法鉴定分离的大肠杆菌,检测其毒力基因携带和耐药性情况。结果表明：大肠杆菌分离率为22.57%（72/319）,其中餐馆、活禽宰杀铺和定点屠宰点分离率依次为29.73%（22/74）、25.00%（24/96）和17.45%（26/149）,污水、地面、羽毛、用具和胴体分离率依次为75.00%（18/24）、21.62%（8/37）、20.54%（23/112）、17.65%（6/34）和15.18%（17/112）;11种毒力基因中除estA、estB、elt外均被检出,检出率为58.33%（42/72）,共检出14种组合型,有4株分离株4种毒力基因同时存在;分离株对阿米卡星、头孢噻肟最敏感,多重耐药比为90.28%（65/72）,以7~10重耐药居多。土鸡屠宰过程中致病性大肠杆菌污染风险高,多重耐药现象严重,应重视养殖合理用药及屠宰卫生环境。