新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7,KAP7）基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1：10 000。     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

新疆4种绵羊羊毛氨基酸含量测定

为了研究遗传及环境对羊毛生产性状的影响,利用高效液相色谱法测定了新疆地区和田羊、卡拉库尔羊、多浪羊、中国美利奴羊4个绵羊品种羊毛中的17种氨基酸含量,探索不同品种绵羊间和同一品种不同品系绵羊间羊毛氨基酸含量的差异。结果表明,和田羊羊毛的氨基酸总含量显著高于多浪羊羊毛,差异显著(P＜0.05);其他品种间氨基酸总量差异不显著。多浪羊羊毛中的Asp、Ser、Glu、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Lys、Ile、Leu、Phe等氨基酸含量均低于其他品种;卡拉库尔羊羊毛只有Cys含量高于其他品种,Ser、Gly、Thr、Pro、Tyr等氨基酸含量均低于其他品种。各品种羊毛的螺旋比值(促螺旋氨基酸含量/阻螺旋氨基酸含量),中国美利奴为0.90,卡拉库尔羊为0.79,和田羊为0.77,多浪羊为0.75。结果表明,和田羊氨基酸总含量高于其他品种,中国美利奴螺旋比值高于其他品种,卡拉库尔羊Cys含量高于其他品种。     

舍饲和田羊与卡拉库尔羊生长发育指标的测定

本研究旨在对新疆南部地方品种绵羊平原型和田羊、山区型和田羊及卡拉库尔羊的17种生长发育指标进行检测分析,了解农区舍饲条件下新疆南部地方品种绵羊的基本生长发育情况。主要进行了2个品种、品系绵羊断奶后7个多月期间的17项生长指标的检测,通过SPSS 17.0统计软件分析其各项指标的差异显著性。结果表明：6月龄时,平原型和田羊与山区型和田羊间体高、尻长存在差异显著性(P<0.05),而后胸宽、尾长、尾宽、尾厚的差异极显著(P<0.01);山区型和田羊与卡拉库尔羊间前胸宽、后胸宽存在差异显著性(P<0.05);平原型和田羊与卡拉库尔羊间体重、胸围存在差异显著性(P<0.05),且前胸宽、后胸宽、尾长、尾宽、尾厚的差异极显著(P<0.01)。所检测各项指标的平均月增长量,平原型和田羊与山区型和田羊间体高存在差异显著性(P<0.05),而山区型和田羊与卡拉库尔羊间体高差异极显著(P<0.01);山区型和田羊与卡拉库尔羊管围存在差异显著性（P<0.05）;平原型和田羊与卡拉库尔羊间尾厚存在差异显著性(P<0.05)。对于绵羊体重、体长、体高、胸围等生长发育规律的研究结果表明,平原型和田羊的生长发育与山区型和田羊以及卡拉库尔羊相比较在这些方面具有优势。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。     

不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1基因差异表达研究

试验旨在研究不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1（keratin associated protein 8-1,KAP8-1）基因相对表达量,从而明确KAP8-1基因对绵羊皮肤毛囊发育的调控作用。采用Real-time PCR SYBR GreenⅠ染料法,测定KAP8-1基因荧光定量Ct值,所得结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。结果表明,南非肉用美利奴羊（♂）×东北细毛羊（♀）组、南非肉用美利奴羊（♂）×小尾寒羊（♀）组、杜泊羊（♂）×小尾寒羊（♀）组3个品种羊皮肤毛囊内KAP8-1基因均有表达,且三者相对表达量的比值为7.56∶2.19∶1。说明KAP8-1基因对皮肤毛囊发育、羊毛品质差异均具有一定的调控作用,且品种之间存在一定的差异。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2（keratin-associated protein 2,KAP2）基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463 bp的KAP2基因,开放阅读框架（ORF）长414 bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸（Arg）变为谷氨酰胺（Gln）,属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84 ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

SHH在美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤表达差异的研究

为了研究音猬因子(sonic hedgehog, SHH)在不同品种绵羊背部皮肤中的表达差异,以探索SHH与羊毛弯曲形成的关系,选取美利奴羊和小尾寒羊作为研究对象,利用HE染色法观察2种绵羊背部皮肤的组织结构,采用免疫组织化学技术、实时荧光定量PCR和Western blot方法探究2种绵羊背部皮肤中SHH蛋白和基因水平的相对表达量差异。结果显示:HE染色显示美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤毛囊的组织结构存在毛囊数量及弯曲程度等差异;免疫组织化学试验显示,SHH蛋白在美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤中均有表达,在美利奴羊背部皮肤中的毛乳头、毛基质、内外根鞘、皮脂腺和表皮细胞中显著表达,在小尾寒羊背部皮肤中的毛基质、内外根鞘和皮脂腺中显著表达;光密度分析显示,美利奴羊背部皮肤组织中SHH蛋白的表达量显著高于小尾寒羊(P<0.001);实时荧光定量PCR显示,美利奴羊SHH mRNA相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01);Western blot显示,美利奴羊SHH蛋白相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01)。提示:羊毛弯曲的形成与其组织结构有关,并受SHH的调控。     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574 bp,其中ORF区192 bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3'UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。     

中国美利奴羊IGFBP-3基因内含子4区的PCR-RFLP多态性分析

本研究针对在绵羊IGFBP-3基因内含子4区新发现的1个SNP位点(C218T),建立了PCR-RFLP的基因分型方法。利用该方法对353只中国美利奴羊(新疆军垦型)进行了多态性检测,结果显示,有CC（249 bp）、CT（249/216/33 bp）和TT（216/33 bp）3种基因型,基因型频率分别为0.52、0.41和0.07;有C、T 2种等位基因,等位基因频率分别为0.72、0.28。多重比较结果表明,不同基因型对中国美利奴部分羊毛生产性能有一定的影响,CC基因型个体的毛丛长度显著短于TT基因型个体(P＜0.05),其毛囊密度显著高于CT和TT基因型个体(P＜0.05)。     

白萨福克羊与中国美利奴羊(新疆型)杂交效果分析

以著名肉羊品种白萨福克羊为父本,中国美利奴羊(新疆型)为母本进行杂交,产生的杂交一代母羊全部留作回交一代的母本,中国美利奴羊(新疆型)特级种公羊作为回交一代的父本进行杂交利用试验。结果表明:杂交一代(F1)3月龄体重、6月龄体重和14月龄剪毛后体重分别较中国美利奴羊(新疆型)提高51.7%、23.7%和8.0%,差异均极显著(P<0.01)。回交一代(B1)3月龄体重和6月龄体重分别较中国美利奴羊(新疆型)提高39.5%(P<0.01)和17.1%(P<0.01)。杂交一代(F1)毛长、毛纤维直径和产毛量分别比中国美利奴羊(新疆型)提高了-14.4%、13.1%和-27.3%,差异也极显著(P<0.01)。回交一代(B1)毛长和产毛量分别比中国美利奴羊(新疆型)降低8.9%(P<0.01)和18.2%(P<0.01)。说明杂种羊肉用性能较中国美利奴羊(新疆型)得到显著改进。但与此同时,毛用性能退化显著。从肉毛兼用性考虑,回交一代要好于杂交一代。     

6月龄德美×内细F_2与内蒙古细毛羊羔羊屠宰性能对比

为探讨德国美利奴羊与内蒙古细毛羊杂交F2公羔的产肉性能和经济效益,对6月龄德美×内细杂交F2公羔和内蒙古细毛羊公羔进行了屠宰对比试验。结果表明：德美×内细F2公羔平均活重、胴体重、净肉重较同月龄内蒙古细毛羊分别增加了5.97、4.19和3.35 kg,分别提高21.36%、34.26%和37.35%;屠宰率和净肉率分别提高10.65%和13.24%,且差异均极显著（P〈0.01）。说明德国美利奴羊与内蒙古细毛羊杂交能显著提高产肉性能。     

6月龄德美×内细F2与内蒙古细毛羊羔羊屠宰性能对比

为探讨德国美利奴羊与内蒙古细毛羊杂交F2公羔的产肉性能和经济效益,对6月龄德美×内细杂交F2公羔和内蒙古细毛羊公羔进行了屠宰对比试验。结果表明:德美×内细F2公羔平均活重、胴体重、净肉重较同月龄内蒙古细毛羊分别增加了5.97、4.19和3.35 kg,分别提高21.36%、34.26%和37.35%;屠宰率和净肉率分别提高10.65%和13.24%,且差异均极显著(P<0.01)。说明德国美利奴羊与内蒙古细毛羊杂交能显著提高产肉性能。     

法国夏洛莱羊与中国美利奴羊(新疆型)杂交对其杂交后代生产性能影响的研究

试验旨在研究法国夏洛莱羊与中国美利奴羊（新疆型）杂交对其杂交后代生产性能的影响。本试验以法国夏洛莱羊为父本、中国美利奴羊（新疆型）为母本进行杂交试验,通过杂交试验初步研究对其杂交1代（F1）、回交1代（B1）体增重及毛品质的影响。结果表明,3月龄时,夏洛莱羊×中国美利奴羊（新疆型）F1代体重分别比B1代（试验2组）和中国美利奴羊（新疆型）提高2.8%（P>0.05）和46.5%（P<0.01）;6月龄时,体重分别提高4.0%（P<0.01）和28.6%（P<0.01）;3月龄、6月龄时B1代（试验2组）的体重分别比中国美利奴羊（新疆型）（对照组）提高42.5%（P<0.01）、23.7%（P<0.01）。在产毛量方面,夏洛莱羊×中国美利奴羊（新疆型）F1代的产毛量与B1代差异不显著（P>0.05）,但与中国美利奴羊（新疆型）相比,夏洛莱羊×中国美利奴羊（新疆型）F1代、B1代的产毛量分别极显著降低了20.4%（P<0.01）和20.1%（P<0.01）;从增重和产毛总的经济效益来看,与中国美利奴羊（新疆型）相比,夏洛莱羊×中国美利奴羊（新疆型）F1代和B1代总的经济收益分别提高了14.80%、10.88%。因此,法国夏洛莱羊与中国美利奴羊（新疆型）杂交可用于杂交优势生产羊肉,但不宜用于羊毛的生产。     

高原型藏绵羊KAP 基因单核苷酸多态性分析

试验旨在寻找角蛋白辅助蛋白(keratin-associated proteins,KAP)基因与产毛性状相关的多态位点,为藏绵羊产毛性状的分子标记提供理论依据。采用PCR-SSCP技术对高原型藏绵羊角蛋白辅助蛋白基因家族中KAP 3.2、KAP 7基因部分序列和KAP 8基因外显子进行多态性分析。结果表明,3个基因座都存在多态性,均检测到AA、AB和BB 3种基因型。KAP 3.2基因以A等位基因为优势等位基因,AA基因型为优势等位基因型;KAP 7和KAP 8基因均以B等位基因为优势等位基因,BB基因型为优势等位基因型。高原型藏绵羊在KAP 3.2和KAP 8基因座达中度多态,而在KAP 7基因座为低度多态,在KAP 3.2和KAP 8位点上基因型频率处于Hardy-Weinberg非平衡状态。测序分析结果表明,KAP 3.2和KAP 8基因上分别存在1个C→T（271 bp）和1个T→C(1122 bp）的突变,均属于同义突变,KAP 7基因5′调控区存在1个T→C（102 bp）的突变。     

绵羊GLP2R基因多态性及其与肉质性状的相关分析

为探索胰高血糖素样肽-2受体（glucagon-like peptide-2 receptor，GLP2R）基因多态性与绵羊肉质性状的相关性，试验选用68只南非肉用美利奴羊×东北细毛羊和102只杜泊羊×小尾寒羊的杂交后代为研究对象，采用Sanger测序方法寻找GLP2R基因外显子11序列的突变位点，根据测序结果分析该突变位点的基因型频率和基因频率及卡方适合性检验、纯合度（Ho）、杂合度（He）和多态信息含量（PIC）。结果显示，绵羊GLR2R基因外显子11处存在C/T突变，存在3种基因型：CC、TC和TT，2种等位基因：C和T，其中在南非肉用美利奴羊×东北细毛羊群体中，TC基因型为优势基因型，在杜泊羊×小尾寒羊群体中，CC基因型为优势基因型；2个群体中C均为优势等位基因。卡方适合性检验结果显示，2个群体的C/T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）；C/T突变位点在群体内变异较小且处于中度多态（0.25 < PIC < 0.5），有一定遗传学意义。不同基因型肉质性状差异结果显示，南非肉用美利奴羊×东北细毛羊TC基因型剪切力显著高于CC和TT基因型，TT基因型失水率显著高于CC和TC基因型（P<0.05）；杜泊羊×小尾寒羊CC基因型剪切力显著高于TC和TT基因型，TT基因型失水率显著高于CC和TC基因型（P<0.05）。本研究在GLP2R基因外显子处发现C/T突变，可能是影响肉质性状的潜在位点，是否能够作为遗传标记还需要进一步探索。     

中国美利奴羊（新疆型）产毛性状的相关及通径分析

利用998只中国美利奴羊（新疆型）周岁资料，应用通径分析方法研究了中国美利奴羊（新疆型）羊毛长度、剪毛后体重、毛弯曲分、毛油汗分和羊毛纤维直径对产毛量的影响程度，结果表明：这5个性状与产毛量的表型相关系数分别为0.5552、0.7048、-0.0759、-0.0917和-0.0105；对产毛量的直接通径系数分别为0.2103、0.6447、-0.0105、0.0324和0.1141。可见，剪毛后体重是影响中国美利奴羊（新疆型）产毛量的主要因素。