山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

山羊痘病毒载体研究进展

山羊痘病毒（GPV）为痘病毒科,羊痘病毒属的一个成员,基因组呈线性,全长约150kb,编码147个开放阅读框。GPV的胸苷激酶基因是复制非必需基因,插入外源基因而不影响病毒复制,TK基因具有高度保守性,可以作为构建重组病毒的同源臂。GPV宿主范围小,对人不具有感染性,对外源基因的耐受性强,是一种更为理想的活病毒载体。国外的研究人员已经构建了多种表达外源基因的重组GPV,我国的相关研究刚刚起步,随着对GPV研究的进一步深入,重组GPV病毒在预防反刍动物疫病中将会发挥重要作用。     

山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定

为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。     

伪狂犬病病毒糖蛋白gp50基因的克隆和表达

从包含伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株ＢａｍＨＩ－７片段的重组质粒ｐＰＲ１２８中分离出含有完整糖蛋白ｇｐ５０基因的２．１ｋｂＤＮＡ片段，用ＫｐｎＩ和ＳｔｕＩ酶切后，将其酶切片段分别克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了２．１ｋｂ片段完整测序用质粒。对其序列进行分析，发现与文献报道结果一致，证明分离的ｇｐ５０基因是正确的。将包含ｇｐ５０基因的２．１ｋｂ和１．６ｋｂＤＮＡ片段分别插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的ｐＧＪＰ－５质粒Ｐ７．５启动子的下游，构建了ｐＧＢＴ５０－３６和ｐＧＢＴ５０－Ｓ２２个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染ＴＫ＋痘苗病毒天坛株的人ＴＫ－１４３细胞或ＣＶ－１细胞，进行体内同源重组。经蚀斑纯化，在ＢｄＵＲ选择压力下，通过光敏生物素标记的探针杂交，获得带有ＰＲＶｇｐ５０基因的重组痘苗病毒。用ＥＬＩＳＡ检测，重组痘苗病毒有特异性ＰＲＶｇｐ５０抗原存在。     

通用伪狂犬病病毒转移载体的构建

克隆伪狂犬病病毒（ＰＲＶ） Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株基因组的ＫｐｎⅠ　Ｊ片段,然后亚克隆其中的ＫｐｎⅠ－ ＰｓｔⅠ片段,缺失重组质粒中的ＥｃｏＲⅠ位点和ＮｏｔⅠ－Ｈｉｎｄ Ⅲ片段;再用ＡｃｃⅠ切去３７８ｂｐ,在此缺失位置插入来源于ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子、多克隆位点和ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ信号,构建了通用 ＰＲＶ转移载体 ｐＢｄＴＫ－Ｕｎｉ。此转移载体为改造 Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。     

含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的     

山羊痘病毒疫苗株ORF64～ORF67的分子特征

为构建胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因缺失活载体疫苗，对山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）疫苗株（AV41）ORF64-ORF67进行了克隆和序列分析。结果表明：在全长3460bp的DNA序列中，包含4个完整的开放阅读框（Open reading flame，ORF）。ORF64核苷酸序列全长396bp，编码病毒膜蛋白；ORF65核苷酸序列全长444bp，ORF64和ORF65有44个碱基重叠。ORF66核苷酸序列全长534bp，编码胸苷激酶，具有保守的ATP结合位点和细胞中TK特征序列。ORF67核苷酸序列全长594bp，编码宿主范围相关蛋白。ORF64-ORF66在脊索动物痘病毒亚科中是完全保守的。与参考的国外GPV进行序列比较，ORF64～ORF67有一些差异，如突变和插入等。同源性分析显示：与羊痘病毒属比较，核苷酸和氨基酸同源性均较高（94．7％～100％）。我国的GPV不同毒株TK同源性为100％。与脊索动物痘病毒亚科中其他成员同源性差异较大（17．3％～65．2％）。将GPV AV41TK与鸡、小鼠和人类的TK氨基酸序列进行比较，分析GPV AV41TK进化关系表明，GPVTK基因在进化上可能起源于宿主细胞的TK1基因。本研究结果显示，在分子水平上我国GPV AV41与国外毒株存在差异，推测可能是GPV AV41疫苗株在致弱过程中发生一定程度的变异。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Bartha株TK-/LacZ+突变株的构建及其生物学特性研究

本研究将伪狂犬病病毒Bartha株基因组与含有LacZ标志基因的TK基因转移质料pUEKPZ共转染猪肾传代细胞PK－5，细胞出现病变后，反复冻融3次收毒，按1：5稀释接种于IBRS－2细胞。在X－gal存在下挑取蓝斑，蓝斑筛选3次，再进行空斑试验，同时用PCR扩增LacZ基因，经3次空斑纯化，随机挑取的空斑均能扩增出LacZ基因，证实所获得的重组病毒为伪狂犬病病毒Bartha株TK^-/LacZ^ 突变株。TCID50试验表明，TK失活对Bartha株在细胞上增殖无影响；Balb/C小鼠试验表明，该突变对Balb/C小鼠的安全性明显高于Bartha亲本毒株。     

携带GFP基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究

本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白（GFP）的重组病毒,以便更快速、准确地检测疫苗效价。利用基因重组技术构建含有GFP基因的重组质粒,并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救,在Vero细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行Western blotting试验,检测外源蛋白GFP的表达情况,测定一步法生长曲线,比较与原始毒株的生物学特性差异。结果显示,本试验成功拯救出携带GFP基因的重组狂犬病病毒毒株SAD-GFP;Western blotting试验结果显示,重组病毒可表达GFP,且随着病毒感染时间的延长,蛋白表达增多;病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响,重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异;传代后GFP仍可在病毒中稳定表达。在连续传代过程中,本试验成功拯救出SAD-GFP重组毒株,GFP基因并未丢失,且蛋白表达量并未降低,证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达,且对病毒生长特性并未产生影响。     

表达牛呼吸道合胞体病毒G蛋白基因的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建与鉴定

为构建表达牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)重组病毒,本研究将人工合成的BRSV全长G蛋白基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过反向蚀斑筛选,得到重组病毒BHV-1/TK-/G+。PCR检测结果证实G蛋白基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组中,间接免疫荧光试验和western blot证实BHV-1/TK-/G+中的G蛋白基因在感染的细胞中获得了表达。本研究为研制BRSV及其他重要牛传染病的BHV-1病毒活载体疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建

在伪狂犬病病毒转移载体pBdTK-Uni的多克隆位点中插入由SV40启动子控制下的IacZ基因表达盒,同时在右侧同源臂下游插入一个1.7kb的KpnI片段,构建成一个新的转移载体pUhi-LacZ.用该载体与Bartha-K61株基因组通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选纯化和PCR鉴定获得了一株稳定表达LacZ基因的伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株,命名为rPrV-LacZ.在不同的细胞(PK-15、IBRS-2、Vero和CEF)上,对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和细胞病变进行比较,未见显著差异.结果表明转移载体pBdTK-Uni具有实用性,可用于构建伪狂犬病病毒基因工程活载体疫苗.     

鸽痘病毒TK基因的扩增、克隆及序列分析

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1 、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。     

小鹅瘟病毒GD-06株的分离鉴定

从广东某地死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾中分离到一株病毒。采用鹅胚增殖病毒，通过电镜观察到细小病毒样粒子；人工感染7日龄健康易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并具有典型小鹅瘟的临床症状和剖检特征。经琼脂扩散试验，用此株病毒感染的鹅胚液制备的小鹅瘟沉淀抗原能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性反应。针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物，扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段。     

A virus vector based on Canine Herpesvirus for vaccine applications in canids

Canine Herpesvirus (CHV) is being developed as a virus vector for the vaccination of European red foxes. However, initial studies using recombinant CHV vaccines in foxes revealed viral attenuation and lack of antibody response to inserted foreign antigens. These findings were attributed both to inactivation of the thymidine kinase (TK) gene and excess foreign genetic material in the recombinant viral genome. In this study, we report an improved CHV-bacterial artificial chromosome (BAC) vector system designed to overcome attenuation in foxes. A non-essential region was identified in the CHV genome as an alternative insertion site for foreign genes. Replacement of a guanine/cytosine (GC)-rich intergenic region between UL21 and UL22 of CHV with a marker gene did not change growth behaviour in vitro, showing that this region is not essential for virus growth in cell culture. We subsequently produced a CHV-BAC vector with an intact TK gene in which the bacterial genes and the antigen expression cassette were inserted into this GC-rich locus. Unlike earlier constructs, the new CHV-BAC allowed self-excision of the bacterial genes via homologous recombination after transfection of BACs into cell culture. The BAC-CHV system was used to produce a recombinant virus that constitutively expressed porcine zona pellucida subunit C protein between the UL21 and UL22 genes of CHV. Complete self-excision of the bacterial genes from CHV was achieved within one round of replication whilst retaining antigen gene expression.     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。