传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

本研究将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)JM-1/10株VP2基因克隆至pcDNA-3.1(+)启动子CMV之后,随后将CMV-VP2基因序列一同克隆入杆状病毒表达系统的质粒 pFastBac^TM Daul中构建了pFast-CMV-VP2。将pFast-CMV-VP2转化Escherichia coli DH10Bac感受态细胞,筛选出重组质粒Bacmid-CMV-VP2。用 Bacmid-CMV-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒vBac-CMV-VP2。将该重组杆状病毒转导BHK-21细胞,48~72 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测到VP2蛋白具有特异性荧光;样品经Western blotting分析,结果显示目的蛋白得到表达。结果表明,本试验制备的重组 vBac-CMV-VP2 既能在昆虫细胞中表达,也可在哺乳动物细胞中表达。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

采用含传染性法氏囊病病毒(HK46毒株)VP2基因的质粒FA-pAlter为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．3kb左右的VP2基因产物；用Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ酶切后纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，将其定向克隆到经Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ不完全酶切后的pcAMBIA3301质粒上，构建成VP2植物表达载体。以电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，并用PCR方法进行了鉴定，为下一步的植物转基因研究生产可食用疫苗打下了基础。     

1株传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

【目的】 研究1株传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩散试验等方法分离鉴定病毒,并扩增其VP2基因,利用Mega 7.0、MegAlign软件将其与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及氨基酸序列比对分析,并进行SPF鸡致病性试验,用实时荧光定量PCR方法测定IBDV拷贝数变化情况。【结果】 成功分离到1株IBDV毒株,命名为GX20210126株。该毒株接种SPF鸡胚可导致鸡胚出现出血、矮化和肝脏发黄、出血及针尖状坏死;且GX20210126对DF-1具有良好的细胞适应性,可引起显著细胞病变。琼脂扩散试验显示,该毒株具有良好的抗原性,病毒液能与IBDV阳性血清之间形成白色沉淀线。VP2基因进化分析显示GX20210126株与国际标准超强毒株在同一个大的分支上,氨基酸序列相似性在86.8%~99.6%之间,其中与UK661株相似性最高,为99.6%,仅有2处氨基酸位点发生改变,即D279N和I272T。以EID₅₀为10^-3.8/0.1 mL,0.5 mL/只的剂量点眼、滴鼻接种8日龄SPF鸡,攻毒后鸡出现羽毛蓬松、精神萎靡、拉白绿色水样粪便等临床症状,剖检可见肌肉、肝脏出血,肾脏尿酸盐沉积,法氏囊萎缩,IBDV拷贝数在感染后第5天达到峰值。【结论】 IBDV广西流行株GX20210126具有超强毒株基因序列特征,人工感染鸡群可导致IBDV典型临床症状和病理变化。     

4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）,分别为河北株（HB）、湖北株（HUB）、山东株（SD）、山西株（SX）。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S（aa 326S-332S）,其222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位是传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S（aa 326S-332S）,其222（P）、256（V）、294（L）和299（N）位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。     

传染性法氏囊病病毒VP2高表达毒株血清型分析与免疫试验

对 2个传染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2高表达毒株 0 0 ZB和 99TA3的血清亚型进行了分析 ,交叉中和试验表明 ,它们属不同的血清亚型。用这 2个毒株分别制备灭活疫苗进行免疫试验 ,试验保护率为 10 0 %,显示出良好的免疫效力。     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆和鉴定

以鸡胚成纤维细胞培养ＩＢＤＶ弱毒疫苗株Ｄ７８，经蔗糖密度梯度离心纯化，电镜下见典型ＩＢＤＶ粒子。用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒基因组，低熔点胶回收，琼脂糖凝胶电泳，可见ＩＢＤＶ典型双节段基因组。根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＩＢＤＶＶＰ２基因的引物。以ＩＢＤＶ基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物，将ＰＣＲ产物适当处理后与经ＳｍａⅠ酶切的ｐＵＣ１９质粒平端连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含Ａｍｐ、Χ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的琼脂平板上培养，产生大量白色菌落。挑取白色菌落，经质粒大小比较分析初步筛选到一重组质粒。以重组质粒ＤＮＡ为模板作ＰＣＲ检测和部分酶切分析证实，该质粒为含Ｄ７８ＩＢＤＶＶＰ２基因的重组ｐＵＣ１９     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因突变对病毒体外复制的影响

为了进一步了解影响鸡传染性法氏囊病病毒( IBDV)复制效率和致病力的分子基础,作者在序列分析的基础上,利用反向遗传操作技术,针对VP2上2个重要的氨基酸位点(222和279),修饰和拯救了相应的2株突变病毒,并研究了突变病毒在体内外的生物学特性.复制动力学数据显示,VP2的222位由酪氨酸突变为脯氨酸可将IBDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制滴度提高6倍以上,而279位氨基酸对病毒复制效率无显著影响.SPF鸡的感染试验显示,222位和279位氨基酸与IBDV的致病力没有关系.本研究首次报道了VP2 222位和279位氨基酸与IBDV复制效率和致病力的关系,有助于更加全面地了解IBDV的基因功能,也将为新型IBDV疫苗的设计提供依据和思路.     

不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2与白喉毒素截短体DT390融合蛋白的真核表达及免疫原性检测

为探究白喉毒素截短体DT390是否对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白具有免疫增强作用,本研究利用有白喉毒素抗性的毕赤酵母表达系统对DT390和VP2进行融合表达,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达的融合蛋白DT390-VP2进行了鉴定。将24只21日龄SPF雏鸡随机均分为4组:VP2组、DT390-VP2组、PBS(对照组)和B87组(阳性对照组),在第0和14天,分别对各组雏鸡进行免疫,在首免后第28天,每只雏鸡接种100 BID₅₀的IBDV BC6/85毒株,采用ELISA法检测免疫前后不同时间各组雏鸡血清的VP2特异性抗体水平,采用法氏囊组织切片HE染色及病理损伤评分来评价法氏囊的损伤程度,评价融合蛋白DT390-VP2在雏鸡体内的免疫原性和保护功能。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,表达和提纯后的目的蛋白确为糖基化的融合蛋白DT390-VP2(91.26 ku)。体内试验结果显示,首次免疫21 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度分别显著和极显著高于B87组(P<0.05)和VP2组(P<0.01);首次免疫28 d后,DT390-VP2组的VP2特异性抗体滴度极显著高于VP2组(P<0.01);与VP2蛋白相比,融合蛋白DT390-VP2减轻了雏鸡法氏囊淋巴滤泡的萎缩程度。综上所述,白喉毒素截短体DT390以融合表达的方式增强了VP2的体液免疫原性,融合蛋白DT390-VP2在一定程度上减轻了IBDV BC6/85毒株造成的组织损伤。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株衣壳蛋白的可溶性表达、纯化与活性分析

为获得高质量的病毒衣壳蛋白VP2,本研究克隆了传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）超强毒株Gx的VP2基因,并亚克隆至载体pCold-Ⅰ,进而获得重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-GxVP2,在Transetta（DE3）工程菌中优化条件进行IBDV衣壳蛋白VP2的可溶性表达,运用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤两种技术串联的方法进行蛋白纯化,运用单克隆抗体介导的Western blotting技术鉴定纯化蛋白的特异性,免疫SPF鸡鉴定纯化蛋白的免疫活性。结果显示,在冷休克条件下,IBDV衣壳蛋白VP2在Transetta（DE3）工程菌中实现了可溶性表达;通过纯化获得了高纯度的VP2,浓度为542 μg/mL;该蛋白不仅能与VP2单克隆抗体特异性反应,还能刺激鸡产生特异性免疫应答,具有良好的免疫活性。本研究在IPTG为1 mmol/L,15℃、120 r/min,诱导时间为24 h的条件下,实现了有免疫活性的IBDV衣壳蛋白VP2的可溶性表达和纯化。高纯度、可溶、具有功能活性的衣壳蛋白的制备,为深入开展IBDV致病机制研究奠定了基础。     

Soluble Expression,Purification and Activity Analysis of Capsid Protein of Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus

To obtain the capsid VP2 with high quality, VP2 gene of very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) Gx was cloned and inserted into pCold-Ⅰ and the prokaryotic expression plasmid pCold-Ⅰ-GxVP2 was constructed. In engineering bacteria Transetta(DE3), the induction conditions of protein VP2 expression were optimized.With affinity chromatography and gel filtration, protein VP2 was purified. With the monoclonal antibody directed Western blotting, protein VP2 was identified. Using SPF chicken, immunocompetence of VP2 was evaluated. The results showed that the dissoluble protein VP2 was expressed successfully in Transetta(DE3) in cold-shock conditions; Protein VP2 was purified and the concentration was 542 μg/mL; The purified protein VP2 not only reacted with the monoclonal antibody against protein VP2, but also induced specific immune response in immunized chickens. In general, with 15℃ of cold-shock condition, 120 r/min of shaking culture, 1 mmol/L of IPTG,inducting for 24 h, soluble capsid VP2 of IBDV with immunocompetence was successfully expressed and purified.The preparation of highly purified, soluble capsid protein with functional activity laid the foundation for further researches on the pathogenic mechanism.     

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析

为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。     

传染性法氏囊病病毒X毒株不同代次的致病性及VP_2可变区序列分析

分别以传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) X毒株细胞适应的第 5代、第 1 1代和第 1 7代毒感染 38日龄非免疫雏鸡进行致病性试验 ,确定 X毒株的毒力 ,并比较 3个代次毒的致病性差异 ,进而利用 RT-PCR扩增其VP2 基因可变区 ,测定其核苷酸序列 ,从分子生态学角度研究了非鸡胚源细胞传代培养对 IBDV X毒株毒力和抗原性的影响。结果表明 ,IBDV X毒株表现为中等毒力 ,在 Vero细胞上传代后 ,其毒力有所减弱。VP2 可变区氨基酸序列有 3个位置发生了替换 ,即第 5代毒氨基酸残基 2 62位为半胱氨酸 ,而第 1 1代毒和第 1 7代毒则变为酪氨酸 ( Cys→ Tyr) ;第 5代毒的 2 90位为缬氨酸 ,而第 1 1代和第 1 7代毒则变为蛋氨酸 ( Val→Met) ;第 5代毒和第 1 1代毒的 31 6位为赖氨酸 ,而第 1 7代毒则变为精氨酸 ( Lys→Arg)。 2 90位氨基酸替换导致该区域二级结构的改变 ,并对 IBDV的抗原性有显著影响。上述结果提示 ,这些氨基酸残基可能对维持IBDV的毒力和抗原性是必要的。通过毒株间 VP2 可变区序列的比较和系统发生树的分析 ,证明 IBDV X毒株与 Bursin-2疫苗毒关系很近。     

传染性法氏囊病病毒VP4酵母双杂交诱饵载体的构建及互作宿主细胞蛋白的筛选

VP4蛋白(viral protein 4)是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种重要非结构蛋白,具有蛋白水解酶活性,剪切多聚蛋白pVP2-VP4-VP3释放出pVP2、VP4、VP3,对病毒蛋白成熟具有重要的作用。为了研究VP4蛋白与宿主细胞的相互作用,本研究将IBDV VP4基因克隆入pGBKT7,构建诱饵载体pGBGtVP4,自激活试验证明其无自激活活性,对酵母细胞没有毒性。运用酵母双杂交技术,从鸡胚成纤维细胞(CEF)文库中筛选VP4的互作蛋白,经初筛、测序和回转验证,获得22个候选互作宿主细胞蛋白,为深入研究IBDV VP4与宿主互作的效应和机制奠定了基础。     

一种获得重组传染性法氏囊病病毒的新方法

采用 RT- PCR技术 ,从传染性法氏囊病病毒 (IBDV)细胞适应株 GZ911中扩增了 A片段的 2个片段 GA5和 GA3,从中国分离的 IBDV超强毒株 L X中扩增了 B片段的 2个片段 L B5和 L B3。将 GA5和 GA3克隆到质粒p Bss K的 Eco R / Kpn 位点 ,将 L B5和 L B3克隆到 p Bss K的 Eco R / Xba 位点 ,获得携带 GZ911完整 A片段基因的质粒 GA- p Bss K和携带 L X完整 B片段基因的质粒 L B- p Bss K。然后将 GZ911的 A片段 c DNA和 L X的 B片段c DNA分别插入带有巨细胞病毒立即早期加强子 /启动子的质粒 p AL TER- MAX中 ,获得重组质粒 GA- p AL TER和L B- p AL TER。用 GA- p AL TER和 L B- p AL TER共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,获得具有感染活性的重组 IBDV,命名为 r IBDV- GZ L X。该方法的建立为在体外对 IBDV的基因组进行遗传操作 ,进而彻底了解 IBDV基因的结构与功能的关系打下了基础。