油菜种子特异启动子Napin控制外源EGFP基因在芥菜中的表达

为研究油菜种子特异启动子Napin在芥菜中的表达特性,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因,将其置于来自油菜的Napin启动子下游,并经根癌农杆菌介导转入芥菜。对转基因芥菜种子及其T1代幼苗的EGFP检测表明：随着转基因植株的种子逐渐发育成熟,EGFP基因在种皮、子叶、胚根中的表达强度逐渐增强|在转基因种子发芽过程中,幼苗根、子叶、下胚轴中EGFP的表达逐渐降低,直至不能检出绿色荧光。结果表明Napin启动子驱动的外源基因表达在芥菜中表现出较为严格的种子表达特异性。     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

月季花瓣特异表达启动子的筛选和鉴定

以月季品种‘萨曼莎’(Rosa hybrida‘Samantha’)为试验材料,选取了13个花色、花香相关的基因,研究其在根、茎、叶和花等器官中的表达规律及其启动子活性。结果表明,RhOOMT2(Rosa hybrida orcinol o-methyltransferase 2)和RhCCD4(Rosa hybrida carotenoid cleavage dioxygenase 4)在花瓣中具有相对较高的表达量,RhNUDX1(Rosa hybrida nudix hydrolase 1)在根部表达量最高,花瓣中其次,在茎和叶中几乎没有表达,另外10个类黄酮代谢途径相关基因在各器官中表达差异较小。使用FPNI-PCR的方法克隆到ATG上游1 601 bp的RhOOMT2启动子、1 539 bp的RhCCD4启动子和1 433 bp的RhNUDX1启动子。将携带RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1启动子的PBI121载体通过农杆菌的介导,在月季‘Samantha’、洋桔梗(Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’)和百合(Lillium Or...     

梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

 以 ‘Old Home’ 梨无菌苗叶片为外植体, 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2 驱动下的GUS 基因转入 ‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’ 梨叶片高效遗传转化的最佳条件：农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。 PCR分析和Southern 杂交鉴定表明GUS 基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western 杂交鉴定证明了GUS 基因在转基因植株韧皮部中的表达。     

GUS基因在农杆菌和甜瓜中的表达差异研究

以农杆茵和转化的甜瓜组织为试验材料,通过组织化学染色法,来研究GUS基因在农杆菌和甜瓜组织中的表达.结果表明,含有GUS基因的农杆茵和甜瓜愈伤组织都能被染成蓝色,而不含有GUS基因的农杆菌和甜瓜愈伤组织没有被染色,因此在检测转基因植株时,可以减少或避免假阳性的出现,为植物的转化奠定了坚实的基础.     

拟南芥抗病基因FLS2和LysM的亚克隆及其在番茄中的表达

 从拟南芥JAtYTAC基因组文库中完整地亚克隆了FLS2和LysM 两个抗病基因, 亚克隆的DNA片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子。利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种‘Moneymaker’, 转基因植株经PCR 初步筛选后再分别提取总RNA 进行RT-PCR, 以验证其是否在‘Moneymaker’中表达。试验结果表明, FLS2和LysM 均能成功地在‘Moneymaker’中表达, 说明番茄的转录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录, 还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含子。据此推测, 拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份, 这为探索在这两个物种间R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。     

柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素处理下的表达

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为试材,分别对Cit ERF9和Cit AP2-7进行了分析。结果表明:Cit ERF9基因的开放阅读框(ORF)为735 bp,含有1个外显子,可编码244个氨基酸残基的多肽。Cit AP2-7的开放阅读框为1 080 bp,具有6个外显子,可编码360个氨基酸残基。同源分析结果显示,这两个基因编码的蛋白与大豆、蓖麻、碧桃、苜蓿等植物中的同源蛋白有81%~84%的相似性。实时定量分析表明:Cit ERF9和Cit AP2-7在植株不同组织间的表达具有明显差异。在根中,Cit ERF9受各种胁迫处理诱导,而Cit AP2-7主要受ABA、Na Cl、脱水等的诱导。在叶中,各种胁迫均对Cit ERF9具有诱导作用,其模式与根中相似,而Cit AP2-7的表达则主要受ABA、ACC、Me JA、SA等激素以及低温和Na Cl的抑制。试验结果表明,Cit ERF9和Cit AP2-7参与了激素和非生物胁迫的响应过程。     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'(Citrus sinensis Osbeck'Cara Cara')果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素β-环化酶(lycopene β-cyclase,Leyb)cDNA片段.序列分析表明,该cDNA长1 654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1 512 bp,可编码504个氨基酸.通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitL-cyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素.     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'（Citrus sinensis Osbeck 'Cara Cara'）果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase,Lcyb）cDNA片段。序列分析表明,该cDNA长1654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1512 bp,可编码504个氨基酸。通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitLcyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

赤霉素及脱落酸诱导芥菜抽薹的效果

将紫丰1号和重庆儿菜种子先于4 ℃春化处理20 d,待两片真叶完全展开后,再对其生长点喷施不同浓度 （300、400、500、600 mg•L^-1）的赤霉素（GA₃）,每隔3 d喷施1次,直至抽薹现蕾。结果表明,促进芥菜抽薹的GA3最佳浓度为500 mg•L^-1。若在喷施GA₃前一天喷施50 mg•L^-1脱落酸（ABA）,则可加强芥菜植株对赤霉素的敏感性,使促进抽薹的赤霉素最佳浓度降低到400 mg•L^-1,其中紫丰1号对赤霉素的敏感性不及重庆儿菜明显     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)为材料,利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明,该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体,并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现,GUS染色主要集中于叶片,而在根、茎、花中染色较浅。此外,不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性,缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性,而分别供0.25 mmol·L^-1 NO₃^-、NH₄⁺和NH₄NO₃的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明,BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。