猪伪狂犬病病毒LC株的分离鉴定及其重要功能基因的进化分析

为确诊广东某猪场母猪流产发病原因,本研究收集该猪场流产死胎的脑、淋巴结、肺脏混合液,进行PCR鉴定、病毒分离培养、半数组织培养感染剂量（tissue culture infective dose,TCID₅₀）测定、猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）重要功能基因（gB、gC、gD、gE）序列测定和进化分析及动物回归试验。结果显示,病料混合液为PRV阳性,接种Vero细胞传至第3代即出现稳定的细胞病变（CPE）,第5代TCID₅₀达到10^-6.8/0.1 mL,PRV gB、gC、gD、gE基因序列测定、同源性及进化树分析显示为,PRV中国变异株,命名为LC株。动物试验显示,LC株对12周龄猪具有一定致病性,可形成PRV典型临床症状及病理变化。本研究分离到一株PRV流行毒株,推测当前使用疫苗Bartha-K61株尚无法完全控制新毒株的流行。     

猪伪狂犬病病毒NP株的分离鉴定

2013年下半年,福建某免疫接种过猪伪狂犬病疫苗(Bartha)的规模化猪场大批妊娠母猪发生流产、新生仔猪发生共济失调的神经症状,疑似为猪伪狂犬病病毒感染发病症状,为确定发病原因,从该猪场疑似伪狂犬病病毒感染的仔猪脑、肝脏和肺脏中分离到一株未知病毒,PCR检测及测序比对鉴定为猪伪狂犬病病毒,并将分离的病毒命名为NP株。用Reed-Muench法测定分离株病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)为10-9.13/0.1mL,动物攻毒试验出现猪伪狂犬病病毒感染的典型症状。试验结果表明,成功分离到一株猪伪狂犬病病毒毒株,为研究福建省猪群伪狂犬病病毒分子流行病学奠定基础。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织等病料中,经PCR扩增出大小为217 bp的伪狂犬病病毒gp50的基因片段,结果证实为猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)感染。随后采用BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒的分离培养,该分离株经细胞传代培养5代后,能够产生典型的细胞病变,经PCR鉴定为伪狂犬病病毒,其病毒感染力达10^8.68 TCID₅₀/0.1mL。最后用10^7.0 TCID₅₀/mL病毒培养物接种家兔,48 h后注射部位出现典型瘙痒、皮肤破损等症状,于72 h后全部死亡。结果表明,该伪狂犬病病毒分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫及诊断研究奠定了基础。     

一例猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从送检的2日龄病猪脑部分离到1株病毒。该病毒接种的Balb／c小鼠出现了典型的伪狂犬病症状,接种BHK-21细胞48h后出现了圆缩、集聚,脱落等典型的细胞病变,猪狂犬病毒阳性血清能特异性的中和该分离病毒。根据GenBank公布的PRV的gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,证实该病毒为伪狂犬病毒。     

猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其部分毒力基因序列遗传变异分析

为了解吉林省猪伪狂犬病毒（PRV）的遗传变异情况,本研究将采集自吉林省疑似发生猪伪狂犬病的临床样品,通过细胞传代、PCR检测和测序分析进行病毒分离鉴定。TCID₅₀法测定分离毒株的病毒滴度,通过家兔感染试验测定分离毒株对家兔的致病性。对TK、gB、gC、gD和gE基因进行PCR扩增和测序,分析其遗传变异情况。结果表明,临床样品经PK15细胞传代后,有3份样品出现细胞病变,经PCR鉴定和测序分析表明,分离获得3株PRV,分别命名为PRV JL03、JL12和JL15株。通过PK15细胞测定分离毒株的病毒滴度分别为10^6.5、10^6.5和10^7.5TCID₅₀/mL。6只家兔分别接种3株分离毒株（10^3.5TCID₅₀/只）后均表现为体温升高、注射部位奇痒和四肢麻痹等症状,且于病毒接种后3~4 d全部死亡。3株分离病毒TK、gB、gC、gD和gE基因推导氨基酸序列分析结果表明,与参考毒株相比,分离株TK基因未发生氨基酸变异;gB、gC、gD和gE基因部分位点发生氨基酸缺失、插入或突变,其中gE基因在第48和496位分别存在1个天冬氨酸的插入,与国内报道的流行毒株变异特征一致。遗传进化树分析结果表明,3株分离毒株TK、gB、gC、gD和gE基因与国内2012年以后分离的参考毒株JS-2012和ZJ01等的上述基因均表现出较高的同源性,说明毒株间亲缘关系较近,位于同一分支;与国外分离毒株NIA3和Becker等亲缘关系较远,位于不同的分支;而与国内早期流行的毒株SC和Ea等亲缘关系介于二者之间。本研究成功分离鉴定了3株PRV变异株,分离毒株对家兔具有较强的致病性,该结果为吉林省PRV流行病学研究提供了新的数据,并为相关后续研究奠定基础。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究

采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达10^7.0 TCID_50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料（脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏）进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞（Vero）,进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID₅₀测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID₅₀为10^-7.5/0.1 mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析

为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID₅₀法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36 h病毒滴度分别可达10^8.35和10^6.63 TCID₅₀/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD₅₀分别为10^2.13及10^3.25 TCID₅₀。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒LX株的分离与鉴定

从辽宁某猪场采集病料,经处理后接种BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-7.8 TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄绿色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径为140~200 nm。该病毒对氯仿、乙醚、酸和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的猪伪狂犬病临床症状且死亡。结果表明,成功分离到1株PRV。     

猪伪狂犬病病毒GXBB株的分离鉴定及gE基因的克隆分析

从广西玉林博白某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价（TCID₅₀）为10^-7.22/0.1 ml。设计扩增PRV gE胞外区基因的引物,能扩增出约947 bp的特异性片段,将扩增出的目的片段进行克隆、测序,并与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.7%～99.4%之间,氨基酸同源性在98.1%～99.1%之间,上述结果证实该分离毒株为伪狂犬病病毒,命名为GXBB株。GXBB株与国内流行毒株同源性很高,说明目前广西PRV流行株变异不大。这为下一步广西伪狂犬病的预防和净化工作提供科学的理论基础。     

猪伪狂犬病病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的综合诊断及感染毒株gE基因遗传进化分析

2019年4月,山东省新泰市某育肥猪场从某种猪场购进了100头5周龄仔猪。购进1周后,有40多头仔猪表现昏睡、呕吐、拉稀等症状并出现急性死亡,共死亡28头,病死率高达68%。对病猪进行病理剖检、组织病理学检查、病原学检测等实验室综合诊断,最终确诊为伪狂犬病病毒和副猪嗜血杆菌的混合感染。对分离的伪狂犬病病毒gE基因进行测序和遗传进化分析,确定该分离株与近期流行株同源性较高,这为该病疫苗的选择和高效使用提供了依据。基于诊断结果,制定了相应的防控措施,使疫情得到了迅速控制。本文还分析讨论了该病例的发生原因、发病特点及病变特征,对类似病例的诊断防控具有一定的指导意义。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。     

Isolation and Identification of Variant HeNZK-2014 of Pseudorabies Virus and Sequence Analysis of gE Gene

In order to learn the situation of pig pseudorabies virus (PRV) variant in this study, tissue samples such as lymph nodes which were collected from clinical pigs with suspected PRV infection were identified by PCR. PRV positive sample were inoculated on PK-15 cells after grinding and degerming, with further experiment including virus isolation, plague purification, PCR and IFA identification, TCID₅₀ confirmed by Reed-Muench method, inoculation test and observation of clinical symptoms in mice. The gE gene of purified PRV and brain tissue samples of dead mice were identified by sequencing analysis. The results showed that the virus grown on PK-15 cells could produce typical cytopathic effect (CPE) after 24 h; After three rounds of plaque purification,the isolate was PRV positive identified by PCR and IFA, and nominated as HeNZK-2014; The TCID₅₀ of the isolate was 10^-9.77/0.1 mL; The virus in 1×10⁸ TCID₅₀ inoculation was able to cause itching, tearing, death in infected mice, and PRV could be detected in tissues of dead mice; The molecular genetic variation analysis of gE gene by PCR amplification and clone sequencing indicated that the gE gene from brain tissue of infected mice shared 100.0% homology with HeNZK-2014, and located in a relatively independent branch with newly pandemic isolates in recent years after 2011, but was far from the classical strains before 2011, and both had two insertion of aspartic acid (D) at sites of 48 and 496 amino acids, which were considered to be the typical characteristics of PRV variants. This study successfully isolated a PRV variant, which laid a foundation for further research on vaccine development, prevention and control against PRV variants.     

猪流行性腹泻病毒SD株的分离与鉴定

利用Vero细胞自安徽合肥腹泻仔猪小肠内容物中分离到一株病毒,经胶体金、PCR方法和攻毒试验,确定为猪流行性腹泻病毒,命名为SD株。SD株在Vero细胞上传代,第8代(F8)开始出现稳定的细胞病变(CPE),F8代的毒价(TCID50)为10-6.25/0.1 m L,F8代细胞培养物接种未吃初乳仔猪,接种仔猪均出现典型腹泻症状,死亡仔猪3头(50%),未死亡猪生长严重发育不良,说明SD株具有较强的致病性。     

猪伪狂犬病病毒HP-SY2022株的分离鉴定

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究对沈阳某养殖场疑似感染PRV的组织病料进行PCR鉴定、病毒分离和纯化、gD、gE基因序列测定及分析、动物回归实验。结果显示：分离株能在ST细胞中产生典型的细胞病变,且PCR显示为PRV阳性;通过gD、gE基因进行序列分析发现,分离株与2011年后分离的PRV变异株位于同一进化分支;氨基酸位点分析发现分离株与PRV变异株具有相同的变异模式。进一步研究其致病性,将纯化后的病毒液接种PRV抗体阴性21日龄健康仔猪,感染仔猪出现典型的PR症状,如呼吸困难、转圈、流涎和划水动作,且在试验期内仔猪全部发病(5/5),其中4头死亡(4/5)。综上,本研究成功分离到一株PRV变异株,将其命名为HP-SY2022。这一研究为丰富我国PRV分子流行病学及后续的免疫防控提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究

本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用10^3.5 TCID₅₀/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达10^3.5 TCID₅₀/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为10^4.5 TCID₅₀/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。     

湖南省4株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其免疫与毒力相关基因的序列分析

为了解湖南省近年来伪狂犬病病毒(PRV)的分子流行病学情况,更好地控制伪狂犬病,2012-2014年从湖南平江、汨罗、浏阳、长沙4地的4个规模化猪场送检的病料(脑组织)中检测到PRV野毒。将脑组织接种PK-15细胞,经PCR和动物接种鉴定为PRV。4个毒株分别命名为PRV-XiangA、PRV-GA、PRV-YY和PRV-LY。对这4株PRV的免疫(gB、gG、gH、gI、gL、gM)与毒力(gE、PK、TK)相关基因进行序列分析,结果显示这4株PRV的免疫与毒力相关基因核苷酸同源性为99.8%~100.0%,说明分离得到的4株PRV变异极小;将这4株PRV与国内外的主要毒株进行序列比对,结果表明这4株PRV与国内的分离毒株同源性很高,与BJ-YT株和TJ株的亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.8%~100.0%,说明当前国内流行的PRV毒株变异较小。