侵染白菜的黄瓜花叶病毒分离物基因组的全序列分析

对浙江省杭州地区白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. commuis Tsen et Lee.）上获得的CMV分离物（CMV-CTL）进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：CMV-CTL的RNA1（GenBank序列号：EF213023）全长为3357个核苷酸（nt）,编码993个氨基酸（aa）的1a蛋白;RNA2 （GenBank序列号：EF213024）全长为3047 nt ,编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3 （GenBank序列号：EF213025）全长为2217 nt,编码278 aa的MP蛋白和218 aa的CP蛋白。序列相似性分析表明,CMV-CTL与CMV亚组IB中株系IA相似性最高,RNA 1、RNA 2和RNA3与该株系的相似性分别为91.3%、91.3%和93.6%。CP基因和RNA 3 的5' NTR核酸序列系统发生树分析表明,CMV-CTL与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组IB。     

侵染番茄的黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯S病毒CP基因克隆及序列分析

以山西省晋中地区表现褪绿黄化、卷曲、叶脉变黑症状的番茄植株叶片为试材,采用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法,对侵染番茄病样的病毒病原进行检测,以期为山西省番茄病毒病的防治提供参考依据。结果表明:该病样由黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯S病毒(PVS)3种病毒复合侵染,将其分别命名为CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ。为明确CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ的分类地位,进一步克隆到了这3个病毒的CP基因序列并进行相似性比较,发现CMV-SXFQ与CMV各亚组代表株系相似性为74.9%~98.8%,氨基酸序列的相似性为82.5%~99.5%;TMVFQ与TMV代表株系相似性为74.4%~99.8%,氨基酸序列的相似性为83.6%~100.0%;PVS-SXFQ与PVS代表株系相似性为93.2%~99.3%,氨基酸序列的相似性为92.4%~100.0%;系统进化分析表明:CMV-SXFQ分离物与亚组ⅠB的CH、HLJ、XJ2、Am、As株系亲缘关系最近;TMV-FQ分离物与IM、Jimo、SXFQ株系亲缘关系最近;PVSSXFQ分离物与Cm、St株系亲缘关系最近。     

小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜和丝瓜分离物全基因组序列分析

在山东泰安采集到两个表现黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV);通过RT-PCR和RACE方法获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(丝瓜分离物)和CN:Lc:17(南瓜分离物)。结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外,分别含有9 593和9 591个核苷酸(Nucleotides,nt),通过多聚蛋白策略编码一个含3080个氨基酸的多聚蛋白。CN:Cm:17和CN:Lc:17在氨基酸水平上一致率为96.7%;CN:Cm:17与韩国分离物KR:RDA:07的氨基酸一致率最高(97.8%); CN:Lc:17与CN:CJLX30535:14和CN:spider131932:13的一致率最高(98.4%)。重组分析发现,CN:Lc:17具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,所有中国分离物分别聚集在A-Ⅴ和A-Ⅵ亚组。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

侵染番茄的苎麻花叶病毒分子特征及其基因序列分析

为明确侵染贵州番茄的菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒种类及其变异分化情况,将采自贵州省关岭县的番茄病毒病样品提取DNA,用Begomovirus通用引物BegoAFor1/BegoARev1进行PCR检测,并用J4F/J4R引物扩增并克隆该分离物的DNA-A全长序列,用RaMV-B-F/RaMV-B-R扩增并克隆该分离物的DNA-B全长序列,所获序列用MEGA软件构建系统进化树,分析其亲缘关系。结果表明,该分离物序列与已报道Ramie mosaic virus(苎麻花叶病毒,RaMV)序列相比,其DNA-A的核苷酸一致性在94.7%～95.5%之间,DNA-B核苷酸一致性在90.4%～92.4%之间。从系统进化树分析,RaMV-GZ的DNA-A和DNA-B与中国其他地区的RaMV DNA-A和DNA-B序列都聚在一支。综上可知,侵染贵州番茄的Begomovirus为苎麻花叶病毒,且其与中国不同省份的RaMV亲缘关系较近。     

辣椒轻斑驳花叶病毒寿光分离物的RT-PCR检测及其序列分析

以山东寿光地区感染辣椒轻斑驳花叶病毒的辣椒为试材,采用试剂盒提取感病辣椒的总RNA并进一步反转录成cDNA,参照已报道的PMMoV检测引物合成特异性引物PMMoV-F和PMMoV-R;以获得的cDNA为模板进行PCR扩增,研究了辣椒轻斑驳花叶病毒寿光分离物。结果表明:得到分子量约是576bp的条带,纯化后进行基因测序;通过测序结果分析比对可知,PMMoV寿光分离物序列与诸多地区的分离物同源性较高,可达到99%~100%。     

豇豆轻斑驳病毒海南分离物全基因组序列测定及分子特征

从海南采集疑似感染豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus,CpMMV）的豇豆病叶,采用RT-PCR 结合测序获得其全基因组序列,CpMMV 海南分离物（KY420906）基因组全长8 193 bp,与其他CpMMV 分离物的同源性为63.00%～83.22%。系统发育分析结果表明,CpMMV 海南分离物单独聚为一个亚簇;重组分析结果表明,CpMMV 基因组有一个重组事件,断点为3 212～3 592 bp。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

苹果锈果类病毒火焰海棠分离物全基因组克隆及序列分析

【目的】检测从山东青岛采集的有"花脸"症状的火焰海棠(Malus‘Flame’)果实是否带有苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)。【方法】提取带有"花脸"症状的火焰海棠果皮总RNA,设计ASSVd特异性引物,利用RTPCR方法进行检测。设计基因特异性引物扩增ASSVd基因组全长,并进行克隆、测序,利用CLC RNA Workbench4预测其二级结构。用DANMAN软件比对来自中国不同地区、不同寄主的苹果锈果类病毒分离物基因序列。用MEGA-7软件分析山东火焰海棠ASSVd分离物与来自不同国家、不同寄主ASSVd分离物的遗传关系。【结果】从山东青岛采集的表现"花脸"症状的火焰海棠果皮中检测到ASSVd,推测火焰海棠果皮的"花脸"症状可能由ASSVd引起。利用基因特异性引物克隆4条ASSVd基因组全长序列,其长度为333～334 bp,在GenBank的登录号依次为MK102981-MK102984。ASSVd序列比对结果显示,来源于不同寄主的分离物存在差异。系统进化树显示ASSVd不存在明显的地区专化性,进一步对ASSVd二级结构分析发现不同寄主的ASSVd致病区(P)存在明显的差异。【结论】从山东青岛采集的带有"花脸"症状的火焰海棠果实带有ASSVd。本研究从火焰海棠检测到ASSVd,明确其为自然寄主之一,且火焰海棠果实的"花脸"症状形成可能与ASSVd侵染有关。     

陕西杨凌地区番茄斑萎病毒外壳蛋白基因的克隆与分析

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是世界上危害最大的十大病毒之一,为了确定陕西杨凌地区的番茄感染TSWV情况,采集该地区4份疑似感染TSWV的番茄样品,通过表型观察以及PCR分子鉴定进行分析。结果显示,2份材料扩增出234bp的特异性条带,表明样品感染了TSWV。采用同源克隆方法获得了杨凌地区757bpTSWV的外壳蛋白基因(CP),其与西班牙TSWV分离物同源性最高,为99%,而与昆明的TSWV分离物亲缘关系较远。     

草坪土壤的N2O产生途径及其对施氮肥的响应

 硝化作用、反硝化作用和硝化细菌反硝化作用是土壤中产生N₂O的主要途径。以常用的冷季型草坪草早熟禾为对象,采用气体抑制剂培养法研究了不同施氮量对草坪土壤N₂O排放及其产生途径的影响。结果表明,对照草坪土壤的N₂O日排放量为7.2 ~ 8.2 g · m^-2 · d^-1,年施氮量10 g · m^-2未改变草坪土壤N₂O排放强度,年施氮量25、35 g · m^-2处理则分别比对照增加1.52倍和1.88倍,但二者之间没有显著差异。对照草坪土壤N₂O产生途径主要以异养硝化作用为主,其贡献率达65.7%,反硝化作用贡献率为34%,自养硝化和硝化细菌反硝化过程几乎不发生。年施氮量25 g · m^-2时,N₂O排放以硝化细菌反硝化、异养硝化和反硝化途径为主,贡献率分别为35%、35%和29%。年施氮量35 g · m^-2时,N₂O排放来自于4个途径,其中反硝化途径占41%,自养硝化途径贡献率增加至20%。     

CMV新疆哈密瓜分离物的寄主反应及其cp序列分析

从新疆16个哈密瓜主栽区采集哈密瓜病毒病样品,利用RT-PCR检测黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）。通过蚕豆的单斑分离纯化,获得了新疆12个哈密瓜主栽区的17个CMV分离物。分析这些分离物的寄主反应和全长外壳蛋白基因序列。结果表明,新疆17个CMV分离物属于CMV的ⅠB亚组。总体来看,新疆CMV分离物的进化分簇没有表现出明显的地区适应性,遗传多样性较低。除曼陀罗外,寄主反应与分离物的地理来源没有明显的相关性。新疆CMV分离物的寄主反应与已报道的来自其他国家的CMV分离物有一定的差异。     

柑橘鳞皮病毒3个分离物全基因组序列分析

运用转录组测序和RT-PCR方法克隆测定了柑橘鳞皮病毒（Citrus psorosis virus,CPsV）3个分离物CHN-1、CHN-2和CHN-3的全基因组。序列分析结果表明,CHN-1、CHN-2和CHN-3的基因组全长分别为11 282、11 279和11 278 nt,均包含4个开放阅读框。CHN-1、CHN-2和CHN-3之间的核苷酸相似性为93.48% ~ 95.98%,编码氨基酸相似性为98.18% ~ 98.86%;与6个已知国外CPsV分离物的外壳蛋白基因核苷酸序列相似性为85.83% ~ 95.23%,其对应氨基酸序列相似性为94.09% ~ 99.32%。系统进化分析显示CHN-1、CHN-2和CHN-3与地中海沿岸国家的CPsV分离物聚为一簇,可能具有共同的起源。     

番茄斑萎病毒病抗性种质筛选及人工接种鉴定方法优化

对154份番茄材料(包括普通番茄76份,樱桃番茄78份)进行两年两次田间番茄斑萎病毒病的病情指数调查,筛选出14份对番茄斑萎病毒病具有稳定抗性的番茄材料,利用sw-5-2共显性SCAR标记对田间表现抗病的材料进行分子标记鉴定,发现3份抗病材料携带抗番茄斑萎病毒病的Sw-5基因。为缩短番茄斑萎病毒病人工接种鉴定周期,以含有sw-5的抗病材料H8和感病材料M82为研究对象,设置4、6、8、10片真叶4个接种时期,分别在接种后14、21、28 d进行病情指数调查和抗性分级,结果表明,6片真叶期接种,接种后28 d进行病情调查即可有效鉴别植株番茄斑萎病毒病抗性,与8、10片真叶期接种效果相同,人工接种抗病性鉴定效率显著提升。     

辣椒抗番茄斑萎病毒病研究进展及展望

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）自19 世纪发现以来,在全世界各地蔓延,对多种作物造成重大经济损失。本文以辣椒为例,从TSWV 的发生与分布、病害症状检测、传播方式、防治方法、抗TSWV 育种及展望等6 个方面对国内外辣椒TSWV 的研究现状进行综述。