致羔羊脑炎粪肠球菌生物被膜形成能力及相关基因检测研究

为观察致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株生物被膜（BF）的形成能力并检测致羔羊脑炎粪肠球菌BF形成相关基因的携带情况,本研究以XJ05为研究对象,运用96孔板建立不同时间BF模型,染色后酶标仪测定D_{595 nm}值,并用倒置显微镜观察BF形态。同时检测11株菌中与BF形成相关基因（gelE、esp、ace、asa1、asa373、efaA、ef0591、ef3314、ahrc、eep）的携带情况,并对相关基因片段做同源性分析。结果显示,在不同时间段XJ05株BF的生成量与空白对照组相比差异显著（P<0.05）,24 h时D_{595 nm}值最高且与其他各个时间段相比均差异显著（P<0.05）。显微镜下观察6 h时BF初具规模,可见散落的网状结构,12~24 h矩阵网格结构明显,24 h时形成高度有序的网格结构,24 h后网状结构逐渐脱落,BF开始降解。11株菌中10种相关基因的携带情况不同,有6株携带8种基因,1株携带7种基因,1株携带6种基因,1株携带2种基因,有2株未检测到10种基因的任何一种。检出的基因片段同源性均在93.3%~100.0%之间。结果表明,XJ05株能形成完整的BF,11株分离的致羔羊脑炎粪肠球菌中有9株携带部分与BF形成相关的基因。     

致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05 LuxS 基因的克隆与原核表达

采用 PCR 技术从致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05基因组中扩增得到 LuxS 基因的全序列,对其进行分析,同时与其他细菌相应基因序列及编码的氨基酸进行同源性分析;构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行鉴定。结果显示,该粪肠球菌 XJ05的 LuxS 基因全长459 bp,编码152个氨基酸,具有功能序列HXXEH,核苷酸同源性与 GenBank 上的枯草芽胞杆菌和粪肠球菌 V583同源性最高,分别为61．2％和100％;构建的重组质粒经诱导后表达分子质量为20 ku 的蛋白质,Western blot 检测显示特异性条带。说明 XJ05的 luxS 基因与肠球菌 V583和枯草芽胞杆菌亲缘关系较近,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

鸡源粪肠球菌对雏鸡致病力试验和毒力基因gelE及efaA的检测

为了解凉山地区鸡源粪肠球菌毒力基因gelE和efaA的基因表达情况,对毒力基因进行检测和致病力试验。通过实验室提供的粪肠球菌10株,进行致病力试验,结果显示,雏鸡死亡率为0～100%,存在较大差异;进行毒力基因gelE(432 bp)、efaA(591 bp)的检测,10株粪肠球菌阳性率均为100%。根据NCBI的基因序列进行粪肠球菌毒力基因gelE、efaA的同源性比对结果均为100%。     

致动物脑膜炎粪肠球菌人工感染小鼠脑部模型的建立

为了构建粪肠球菌人工感染小鼠脑部损伤模型,以清洁级昆明小鼠为实验动物,将实验室保存的致羔羊脑膜炎粪肠球菌进行复苏,用寇氏法测定小鼠半数致死量(LD50),并以LD50剂量、1/2 LD50的剂量、2/3 LD50剂量感染小鼠,观察临床症状,选择2、4、8、12、24、36、48、60、72、84 h共10个时间点,无菌取其脑部、内脏组织进行细菌的分离鉴定,并观察病理组织学变化。结果显示,粪肠球菌的LD50为7.59×10^8CFU;感染小鼠后,其致死率1/2 LD50剂量组为3.7%,小于2/3 LD50剂量组的13.0%;1/2 LD50剂量组脑组织开始出现病理变化是在感染后12 h,晚于2/3 LD50剂量组(6 h),病理变化与后者相比较轻。结果表明,选择以2/3 LD50剂量为小鼠感染模型的最佳剂量。该动物模型的建立为进一步研究粪肠球菌感染小鼠导致脑炎奠定了基础。     

猪源肠球菌明胶液化表型与5种毒力基因的检测分析

为探究明胶液化的表型与其5种毒力基因在不同来源和不同种属猪肠球菌中的分布差异,本研究采用PCR方法以及明胶液化试验对湖南分离的375株肠球菌携带的明胶酶基因(gelE)、调控gelE表达的毒力基因反应调节子基因(fsrA)、前肽加工蛋白基因(fsrB)、组氨酸激酶基因(fsrC)、丝氨酸蛋白酶基因(sprE)共5种毒力基因的分布情况以及液化明胶现象进行检测。结果显示,共263株肠球菌检测到了毒力基因,检出率分别为41.3%(gelE)、45.9%(fsrA)、50.9%(fsrB)、48.8%(fsrC)、48.8%(sprE)。能够同时检测到5种毒力基因的菌株共有110株,其中粪肠球菌106株,且该5种毒力基因在106株粪肠球菌中的检出率均为最高,另外4株为其它肠球菌。在明胶液化试验中,共有155株肠球菌检测到gelE基因,但只有106株能够发生明胶液化现象,且这些菌株正是能够同时检测到5种毒力基因的106株粪肠球菌,而另外4株能够同时检测到5种毒力基因的其它肠球菌却不能发生明胶液化现象。结果表明,粪肠球菌是肠球菌中主要携带毒力基因的菌属,与屎肠球菌以及其它肠球菌相比,更容易出现液化明胶的表型,这可能与粪肠球菌中某些明胶液化的机制有关,且除gelE外,参与gelE表达的几种毒力基因对该表型的出现也具有一定的影响。     

粪肠球菌感染小鼠的脑组织病理学观察及转录组学差异分析

旨在通过构建小鼠感染粪肠球菌后的脑部损伤模型,对不同感染时期脑组织的病理学观察及转录组学差异分析,探索粪肠球菌引起脑组织损伤的机制。本试验选择1株致脑膜炎粪肠球菌,以小鼠为感染动物,感染粪肠球菌后,分别在2、4、6、12、24、36、60和72 h采集小鼠脑组织,观察脑组织的损伤程度,挑选早期、明显期和转归期3个时间点,通过转录组学测序,对差异表达基因进行分析,使用荧光定量PCR对转录组学数据进行验证。结果显示：小鼠感染粪肠球菌12 h后,脑组织开始出现病变,通过病理组织学观察发现小鼠脑组织先后出现了脑膜及脑组织血管充血,血管周围间隙增宽,脑组织因水肿有网格状间隙,微血栓形成及炎性细胞浸润。对转录组学差异基因分析,GO富集结果显示主要富集到对β干扰素的反应、细胞对β干扰素的反应、对其他生物的防御反应、对γ干扰素的反应、对细菌的反应、外在凋亡信号通路、调节外在凋亡信号通路、神经元凋亡过程、内皮细胞迁移等生物进程中。KEGG富集结果显示差异信号通路主要富集在过氧物酶体、NOD样受体信号通路、氧化磷酸化、钙代谢信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径、Wnt信号通路、MAPK信号通路、GnRH分泌、VEGF信号通路、紧密连接等一些与脑组织损伤相关的通路上。粪肠球菌感染小鼠后,影响脑组织过氧物酶体、NOD样受体信号通路、氧化磷酸化、钙代谢信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径等通路改变,这些通路与蛋白磷酸化、炎症的发生及血脑屏障通透性的改变有关,为进一步研究粪肠球菌引起脑组织损伤机制提供研究方向和理论基础。     

猪源粪肠球菌的分离、鉴定及应用

通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、16SrDNA序列分析和种特异性片段扩增等方法,从健康猪直肠内容物中分离到3株粪肠球菌,其中菌株NA14对常见病原微生物具有较强的拮抗能力;进一步研究表明该菌株具有较强的耐受人工胃液和耐胆汁的能力,能够耐受60℃、30min;动物试验表明饲料中添加该粪肠球菌能够降低仔猪腹泻,改善仔猪生产性能,增强猪瘟疫苗的免疫效果;因此该菌株作为动物益生菌具有好的应用前景。     

致羔羊脑炎粪肠球菌的分离鉴定

为确定某羊场导致羔羊脑炎的病原,对从3只病死羔羊脑、肝、脾、淋巴结等组织中分离到革兰阳性球菌,采用生化试验、PCR检测、16SrRNA序列分析、进化树分析、药物敏感性及小鼠致病性测定进行鉴定。结果表明,分离菌符合粪肠球菌的生物学特性;对小鼠致病性较强;对庆大霉素、红霉素、克林霉素、万古霉素等有较强的耐药性,对呋喃妥因极敏感,对青霉素、氨苄西林、环丙沙星等敏感;应用DNA Man软件对分离株WS1、WS2、WS3、WS4、WS5 16SrRNA基因序列进行同源性比对,结果与GenBank数据库中粪肠球菌(NR-040789.1)的同源性分别为99.2%、99.0%、98.5%、98.5%和98.8%;经MEGA4.0软件分析的分子系统进化树(N-J法)表明5株分离菌与粪肠球菌之间的亲缘性最近。说明该羊场导致羔羊脑炎并死亡的病原为粪肠球菌。     

Enterococcus faecalis of human and poultry origin share virulence genes supporting the zoonotic potential of E. faecalis

Enterococcus faecalis is a major cause of nosocomial infections in humans and has been linked to severe extra‐intestinal infections in poultry. A zoonotic potential has been suggested and the aim of the present study was to investigate similarities in virulence gene profiles of E. faecalis originating from infections in humans and poultry respectively. A total of 106 isolates of E. faecalis [26 human clinical isolates, 60 poultry clinical isolates (including two small‐colony variants (SCVs) and 20 poultry cloacal isolates] were investigated for presence of seven virulence‐associated genes: ace, asa1, cylA, efaA, EF0591, esp and gelE. For each gene, the PCR‐amplification product was sequenced from one isolate in each group to explore intragenic variations between genes of human and poultry origin. Haemolytic and protease activities were assessed and isolates were assigned a sequence type (ST). Three of the seven genes investigated (ace, efaA and gelE) were present in all isolates. The asa1 was detected in 63/80 and 13/26 isolates of poultry and human origin respectively. For cylA, the numbers were 46/80 and 14/26 respectively. Among poultry isolates, esp and EF0591 were the least frequently observed genes (1/80 and 20/80 respectively); the prevalences among human isolates were 1/26 and 18/26 respectively. A high degree of similarity between genes in human and poultry isolates were confirmed by sequencing of amplification products. None of the cylA‐positive isolates demonstrated haemolytic activity, while the phenotypic expression of gelatinase varied. The ST16 was the only ST shared by human and poultry isolates. The SCV isolates did not show a unique virulence profile or phylogeny. In conclusion, regardless of the distinct phylogenetic background of most E. faecalis isolates of human and poultry origin, we found major similarities in virulence gene profile and gene sequences in isolates from the two sources, supporting the zoonotic risk associated with this organism.     

粪肠球菌动物致病的研究进展

粪肠球菌又称粪链球菌,能在不同环境中生长存活,对外界环境抵抗力较强,部分属于动物肠道中的正常茵群,还有部分在长期的进化中出现了毒力基因。近年来,粪肠球菌感染人和动物的报道日益增加,逐渐得到人们的广泛关注。论文综述了猪、牛、羊、禽和犬粪肠球菌的主要致病性、毒力基因及耐药性,为防制动物粪肠球菌感染提供参考。     

新疆北疆地区猪源粪肠球菌的耐药性分析

为了解新疆北疆地区猪源粪肠球菌的耐药性及相关耐药基因型的分布情况,本试验采用K-B（Kirby-Baller）琼脂扩散法检测了49株猪源粪肠球菌对8种抗菌药物的敏感性,并采用PCR法对9种相关耐药基因进行检测并测序,测序结果与GenBank中的相应基因序列比对。药敏试验结果显示,分离菌对链霉素耐药率最高,其次为青霉素和红霉素,对呋喃妥因、氨苄西林高度敏感。PCR检测结果显示,β-内酰胺类耐药基因tem的检出率最高,为93.88%,其次是四环素类耐药基因tetM,为85.71%,喹诺酮类基因gyrA和parC检出率均为42.86%,氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅲ、aac（6'）/aph2″和ant（6'）-Ⅰ的检出率分别为36.73%、16.33%和16.33%,未检出mefA和ermB基因。本试验从表型与基因型分析发现,北疆地区猪源粪肠球菌的多重耐药现象非常严重,且其耐药表型与基因型并不完全一致。     

屎肠球菌及其微生态制剂的研究进展

屎肠球菌作为一种潜在的新型饲用抗生素替代品,具有耐热、耐胃酸、耐胆盐、粘附力强、抑菌性和抗生素耐受性等优良的生物学特性,还能提高饲料的转化效率,增强动物机体的免疫力,降低腹泻率及死亡率,从而改善动物产品品质,屎肠球菌微生态制剂在畜禽养殖业中应用已十分广泛。其中微囊化屎肠球菌活菌制剂更是近几年的研究热点,其抗逆性强、稳定性高,可以作为饲用高活性微生态制剂应用于实际生产。本文主要阐述屎肠球菌的生物学特性及其在饲用微生态制剂中的研究进展。     

某养殖场鸡源粪肠球菌分离鉴定及耐药性研究

本文从辽宁某鸡场100份肉鸡盲肠拭子中分离获得粪肠球菌24株,通过ATB细菌鉴定仪进行鉴定确认为粪肠球菌,并对这24株粪肠球菌进行了14种抗生素的药敏试验。结果显示,粪肠球菌对青霉素、万古霉素、氨苄西林和替拉考宁敏感;对红霉素、氯霉素、环丙沙星、四环素、左氧氟沙星和奎奴普汀/达福普汀耐药,耐药率均达到100.0%,养殖场抗菌药物耐药严重。     

致鹅败血症粪肠球菌的分离鉴定

为确定导致通辽某鹅场雏鹅败血症的病原,本研究将从病鹅心、肝、淋巴结和脑组织液中分离的革兰氏阳性球菌纯化培养,进行形态学和生长耐受性观察,菌属区别、分群和菌种鉴定试验,16S rDNA检测、系统进化分析和致病性试验。结果表明,分离菌株(HQ831431)为中等致病力粪肠球菌,具有β型溶血特性,可致小鼠急性败血症。分离菌株与参考菌株ATCC29212及国内外分离的其他15株粪肠球菌16S rDNA的同源性均在99.0%以上,位于系统发育树的同一分支。     

浣熊源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析

为探究从四川某动物园1例病死浣熊肝脏中分离到的1株细菌的特性和耐药程度,本试验采用病原分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA测序、致病性试验、药敏纸片扩散法及耐药基因扩增的方法对该分离株进行了形态学及生化鉴定、致病能力和耐药程度分析。结果显示,分离株在普通LB培养基上呈现表面光滑、圆形凸起、边缘整齐、针尖大小的半透明菌落。经革兰氏染色在油镜下观察到蓝紫色球菌,测序结果与GenBank登录号为KY003107.1粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的同源性高达99.5%,形态学与生化鉴定特性与粪肠球菌特性相符。致病性试验表明,该菌可导致肝细胞肿胀、变性,具有一定的致病能力;药敏纸片和耐药基因扩增试验表明,该菌对14种常见的抗生素头孢西丁、头孢哌酮、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、氨苄西林、卡那霉素、链霉素、奈替米星、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素、多西环素、四环素耐药,仅对万古霉素和庆大霉素中度敏感。四环素耐药基因tetC检测为阳性;tetM、tetA检测为阴性,氨基糖苷类耐药基因aac （6'）/aph（2″）检测为阳性,aph（3'）-Ⅲ、ant（6）-Ⅰ检测为阴性;大环内酯类耐药基因ermB检测为阳性,ermA、ermC检测为阴性;万古霉素耐药基因vanA、vanB和β-内酰胺类耐药基因TEM检测均为阴性。该试验从浣熊肝脏分离的粪肠球菌表现出多重耐药特性并具有一定的致病能力,结果可为动物园临床肠球菌感染的病例提供一定的药物选择参考,制定合理的感染防治方案。     

猪源粪肠球菌的基因型及耐药性分析

为了解上海地区规模化猪场中粪肠球菌的耐药性和基因型,2013年3月-2014年5月从上海地区10个规模化养猪场收集到分离鉴定的粪肠球菌133株,采用微量肉汤稀释法对12种抗菌药物进行药敏试验,采用PCR技术分别检测分离株中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类抗生素耐药相关基因[aac(6’)/aph(2")和aph(3’)-Ⅲ和ant(6)-Ⅰ]、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(ermB和mefA)和万古霉素耐药相关基因(vanA和vanB)。结果显示,在133株粪肠球菌中,耐药基因ermB、tetM、TEM、ant(6)-Ⅰ、aac(6’)/aph2"、aph(3’)-Ⅲ、vanA的检出率分别为:95.5%(127/133)、91.0%(121/133)、63.2%(84/133)、45.9%(61/133)、42.1%(56/133)、24.1%(32/133)、3.0%(4/133);未检出mefA和vanB基因的菌株。分离菌株对12种抗菌药物的耐药性较为严重,且以6~9耐为主要耐药株,占81.2%。试验表明,上海地区猪源粪肠球菌多重耐药现象严重,携带抗菌药物相关耐药基因是导致分离株耐药的主要原因。     

猪源粪肠球菌的BIOLOG系统鉴定及其生物学特性

利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定，并对其生物学特性进行了系统研究。结果显示，2种鉴定方法的结果一致，与传统的鉴定方法相比，BIOLOG自动微生物分析系统更快捷、方便、高效，可快速为临床诊断和用药提供依据。生物学试验表明，本株粪肠球菌在液体和固体培养基内均可有效抑制大肠杆菌生长，从而维持肠道平衡；另外，该菌株可使培养液的pH值降低至3．69。上述结果为该菌株的进一步开发利用提供了理论支持。     

粪肠球菌R-WL发酵培养基的优化

本试验旨在优化培养基提高粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R-WL发酵液的菌体密度,为高效、优质的微生态制剂产品研制奠定基础。首先通过生长曲线的测定、培养条件和培养基成分的单因素试验,确定菌种RWL的最适培养条件为:时间14 h、pH 8.5、温度37℃、接种量3%,最适碳源为乳糖,浓度为10 g/L,最适氮源为蛋白胨+酵母膏,浓度为30 g/L。然后通过Plackett-Burman试验分析培养基中对粪肠球菌发酵影响最重要的主要因素为蛋白胨、乙酸钠和柠檬酸二铵,再通过最陡爬坡试验获得主要因素的最适范围,最后通过Box-Behnken试验和响应面分析得到主要因素的最适添加量。结果表明:最优发酵培养基配方为:乳糖10 g/L、酵母膏15 g/L、蛋白胨12.18 g/L、乙酸钠4.5 g/L、柠檬酸二铵4.5 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、轻质碳酸钙3 g/L,初始pH 8.5。通过试验验证,优化后发酵培养基的发酵菌液活菌数可达(6.44±0.10)×109cfu/mL,比原MRS培养基活菌数提高了71.28%。     

Isolation and Identification of Enterococcus faecalis from Fur-bearing Animals

In order to obtain Enterococcus faecalis from fur animals and evaluate its prebiotic properties,in this study,Enterococcus faecalis was isolated from the feces of healthy adult fur-bearing animals (mink,fox,raccoon dog),identified by morphological observation,biochemical test and 16S rRNA sequence analysis.The growth curve,acid production capacity and antibiotic sensitivity of the Enterococcus faecalis isolates were measured to evaluate their probiotic properties.Some strains were selected to determine their tolerance to temperature,artificial gastric juice and artificial bile salt.The results showed that five strains were Gram-positive,and their biochemical characteristics were basically consistent with the standard strains of Enterococcus faecalis,and they were identified as Enterococcus faecalis by 16S rRNA sequence analysis.The five strains all entered the logarithmic phase at 2 h after culture,and entered the stable phase at 8-10 h,and had weak acid production capacity.The resistance rate of the isolates to tetracycline and levofloxacin was 100%,followed by penicillin (80%),erythromycin (80%),gentamicin (80%) and chloramphenicol (40%).All the isolates were sensitive to ampicillin and vancomycin.Enterococcus faecalis from mink,fox and raccoon dog had strong tolerance to temperature below 60 ℃,artificial gastric juice with pH>3.0 and 0.3%-0.5% concentration of bile salt,but poor tolerance to temperature above 70 ℃,and artificial gastric juice with pH<3.0.In conclusion,five strains of Enterococcus faecalis from fur animals (mink,fox,raccoon dog) were obtained in this study.The isolated strains propagated rapidly,which were suitable for colonization and played a prebiotic role in fur animals' intestines,and had good prebiotic characteristics and stress resistance.They could be used as candidate strains for animal microbiological agents for further study.     

毛皮动物源粪肠球菌的分离鉴定

为获得毛皮动物源粪肠球菌,并评价其益生特性,本研究从健康成年毛皮动物（水貂、狐狸、貉）粪便中分离粪肠球菌,通过形态学观察、生化试验和16S rRNA序列分析等方法进行种属鉴定。测定分离菌株生长曲线、产酸能力、抗菌药敏感性,并挑取部分菌株测定其对于温度、人工胃液、人工胆盐的耐受能力。结果表明,分离菌株中共5株为革兰氏阳性菌,生化特性与粪肠球菌标准株基本相符,且经16S rRNA序列分析鉴定为粪肠球菌。5株菌均于培养后2 h进入对数期,8~10 h进入稳定期,且具有弱产酸能力。分离菌株对四环素、左氟沙星耐药性强,耐药率为100%,其次为青霉素（80%）、红霉素（80%）、庆大霉素（80%）、氯霉素（40%）,对氨苄西林和万古霉素敏感。水貂、狐狸和貉源的粪肠球菌对于60 ℃以下温度处理、pH>3.0的人工胃液、0.3%~0.5%浓度的胆盐耐受能力较强,对70 ℃以上高温和pH<3.0的人工胃液耐受性差。综上所述,本研究共获得5株毛皮动物源（水貂、狐狸、貉）粪肠球菌,分离菌株繁殖较快,适合在毛皮动物肠道中定植并发挥益生作用,且具有较好的益生特性和抗逆性,可作为动物用微生态制剂的候选菌种进一步研究。