猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析

为了解江西地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树。结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%。ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变。遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a。本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制。     

两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间.     

4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树.结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4％～99.8％,与国内外101株PCV2参考毒株核...     

6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析

参考GenBank发表的PCV-2全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV-2流行株的全基因,并进行了序列测定分析。结果表明,6个分离株基因组全长为1 768 bp或1 767 bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5%~100%,与GenBank上已发表的PCV-2分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。     

上海市猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从上海市临床病料中提取PCV-2基因组DNA,进行PCR全基因扩增。回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV-2序列与GenBank中登录的国内外PCV-2毒株进行同源性比较。结果显示,PCV-2上海株与国内外毒株的核苷酸同源性高达95.0%～100%。进化树分析结果显示,其中9株PCV-2病毒属于PCV-2b亚型,3株PCV-2病毒属于PCV-2a亚型,且9株PCV-2b亚型毒株部分核苷酸位点显示其属于强毒力毒株。研究表明,上海市PCV-2感染以PCV-2b亚型为主,且氨基酸位点表明其具有较高的毒力。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。     

猪圆环病毒2型河北株的全基因组克隆与系统进化分析

应用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出PCV-2全基因组（1767bp）,将此基因片段克隆入pMD20-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV2并对其进行序列测定,然后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明,PCV-2分离毒株与参考株的全基N组同源性介于94％～98．4％之间,ORF1的同源性介于97．0％～98．8％,ORF2的同源性略低,介于91．9％～98．4％之间。该毒株与荷兰株、广西株和上海株等在一个进化分支上。本研究有助于监测PCV-2的疫源和进化关系,为进一步深入研究病毒基因功能奠定一定基础。     

猪圆环病毒2型山东分离株全基因组的克隆与序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因组序列,设计一对特异性引物,从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中扩增出PCV-2基因组DNA,将基因片段克隆于pMD18-T载体,筛选获得含有相应片段的阳性重组质粒pMD18-T-PCV-2。对筛选出的阳性质粒进行测序。结果表明,PCV山东株的全基因组为1 767 bp,与国内外毒株核苷酸同源性高达99.6%。     

Genome Sequence Analysis of Porcine Circovirus Type 2 Strains from Shanxi Province

In order to study genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains in Shanxi province, the genomic sequences of four PCV2 strains which were SXXZ1, SXXZ2, SXTY and SXJZ were isolated recently from some areas of Shanxi province, they were amplified, cloned and sequenced. The amplified PCV2 genomic sequences of these four strains were analyzed and compared with that of 34 published PCV2 stains by DNAStar and drawing phylogenetic tree. The results showed that the genomic sequences of SXJZ PCV2 strain was 1 768 bp, and the others were 1 767 bp, which accounted for 25% and 75%, respectively. The homologies of nucleotide sequences of the four strains were 95.9% to 100.0%, the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the 34 isolates from different regions of the world PCV strain were 94.5% to 99.9%, and the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the domestic vaccine strains were 95.6% to 99.8%. The phylogenetic tree analysis showed that SXXZ1, SXXZ2 and SXTY belonged to PCV-2b genotype, and SXJZ belonged to PCV-2e genotype. The evolutionary relationship among SXXZ1, SXXZ2 and the QY strain of Guangdong were closer, we also found a recent evolutionary relationship between SXTY and AUT5 of Austria, and a recent evolutionary relationship between SXJZ and FJ of Fujian. Besides the evolutionary relationship among SXXZ1, SXXZ2, SXTY and the DBN-SX07-2 of PCV2 vaccine of Shanxi province, a recent evolutionary relationship between SXJZ and LG of PCV2 vaccine were found. Thus PCV2 strains were popular based on PCV-2b in Shanxi province, also PCV-2e was isolated and existed. It laid a foundation for the molecular epidemiology, genetic variation, prevention and control of PCV2 in Shanxi province.     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型广西流行株序列比较分析

参考GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计引物,通过反向PCR技术,从广西部分市区疑似"高热病"病猪的组织中,扩增9株PCV-2流行株的全基因,并进行了序列测定分析.结果表明,9个PCV-2分离株基因组全长为1 767 bp或1 768 bp.同源性比较发现,9个分离株之间的核苷酸同源性为94.6%～99.9%,与GenBank上已发表的国外分离株比较,同源性为94.4%～100%;9个分离株ORF2之间的核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为93.7%～99.4%和93.6%～99.1%;系统发育树显示,其中7个分离株与法国株、新西兰株关系较近,与美国株和加拿大株关系较远;另外2个分离株与澳大利亚株、美国株亲缘关系较近.     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）遗传变异情况，本研究采用首尾重叠的11对特异性引物，对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增，将扩增片段进行反复测序，序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列，应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析，并构建系统进化树。结果显示，SH202003株基因组全长为15 690 bp，编码6种结构蛋白（N、P、M、F、H和L），H和L基因间隔序列为CUA，L和5'端尾随序列为CAA，与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高，达到98.6%和96.6%，与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%，氨基酸相似性只有82.7%~87.0%；全基因进化树中，SH202003株与流行野毒株在同一分支，与疫苗株在不同的分支；H基因同样与Hebei株亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%，与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远；SH202003株处于Asia-1型分支，属于Asia-1型强毒株；SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点，与强毒株Hebei株一致。研究表明，上海株SH202003属于CDV强毒株，为Asia-1型，其H基因序列相对保守，具有9个潜在N-糖基化位点，但是全基因序列存在较多突变，与疫苗株的匹配度较差，可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。     

猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

为分离鉴定流行于重庆某猪场的猪圆环病毒2型,本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的淋巴结病料中进行病毒学检测,病毒利用PK-15细胞增殖,其基因组序列经克隆、测序、拼接获得,并完成对全序列的生物信息学分析鉴定。结果获得了1株猪圆环病毒2型(命名PCV-2CQ1),该毒株的全序列大小为1 767bp,同源性分析发现该病毒与国内公布的PCV-2毒株同源性超过了90%,尤其与广西分离株同源性达100%;系统进化分析本分离病毒与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起,形成一个进化分支,同属于PCV-2b型;对编码的衣壳蛋白分析发现,PCV-2CQ1Cap氨基酸发生了较大变异,与强毒株同源性较高,考虑到本病毒源自PMWS病猪,推测该毒株属于强毒株。     

Comparative genetic characterization of Porcine Circovirus type 2 samples from German wild boar populations

PCV-2 is involved in "postweaning multisystemic wasting syndrome" (PMWS), "porcine dermatitis and nephropathy syndrome" (PDNS), respiratory and reproductive disorders, and thereby plays a crucial role in today's swine production world-wide. The virus is apparently ubiquitous in domestic pigs and has also been demonstrated in wild pigs. Up to now, a characterization of PCV-2 samples from wild pigs, which might help to estimate the possible role of wild pigs as sources of domestic pig infection, has not been carried out. Spleen samples from 16 PCV-2-positive wild pigs from hunting grounds of four regions in Germany were used for the analysis of the viral genome. In one sample, the complete sequence of the genome was determined. In the other, a 742 nucleotide fragment from the highly variable capsid sequence of the ORF2 was sequenced. Analysis of the sequences led to the identification of three PCV-2 strains. One strain, representing 14 of the 16 samples, was closely related with Chinese, but not with German strains. The genome of this strain was shortened by one nucleotide by a deletion close to the end of ORF2. The deletion led to a shift of the stop-codon and to the insertion of a further codon. Two further strains differed in up to 4.7% of nucleotides and up to 10.5% of amino acids (aa). These strains were aligned with clusters of PCV-2 samples from mainly French and German domestic origin.     

猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析

对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近.     

辽宁地区猪圆环病毒2型全基因克隆与序列分析

本试验旨在为辽宁地区猪圆环病毒2型(PCV2)的流行病学调查及选择同源性高的毒株进行灭活疫苗研制奠定基础。采集辽宁沈阳、朝阳、铁岭、大连等地疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病仔猪的病料,利用PCR方法进行PCV2特异性检测,对10份阳性病料进行全基因组克隆和测序分析。结果显示,10株PCV2辽宁株全为强毒株,9株全长1767 bp,1株1768 bp,差异是在1039 bp处多了1个T碱基。与GenBank中的两株疫苗株(HM038034、JQ692110)的核苷酸同源性为95.1%~98.5%,在遗传进化树上,JHZ2为PCV2a型,其余9株毒株为PCV2b型,并且DLS38、LYD32、SYX7在同一小分支,都是同年2~3月发病。10株PCV2 ORF2的氨基酸同源性为89.6%~100.0%,变异度大,存在35个变异点,以突变为主,唯一的糖基化位点(NYS)保守。结果表明,10株辽宁株PCV2抗原性没有明显变化,说明近年来辽宁省猪群中PCV2相关疾病(PCVD)不是因PCV2出现变异株引起的,并且PCV2b型为主要流行型,怀疑PCV2的流行与季节性有关。     

Cloning and Sequence Analysis of Complete Genome of Porcine Circovirus Type 2 from Liaoning Province

It was aimed to lay a foundation for epidemiological survey of porcine circovirus type 2(PCV2) in Liaoning province and selection of highly homologous strain inactivated vaccine.Some pigs suspected of having postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) from Shenyang,Chaoyang,Tieling,Dalian and other places in Liaoning province,were detected by PCR method,then the whole genome of 10 positive samples were cloned and sequenced.The result showed that all of them were virulent strains,9 strains were 1767 bp and 1 strain was 1768 bp,and there was a T base additon at 1039 bp.The nucleotide homology was 95.1% to 98.5% with HM038034 and JQ692110.In the phylogenetic tree,JHZ2 was PCV2a type,the other 9 strains were PCV2b type,DLS38,LYD32 and SYX7 were in the same branch and same onset time.The amino acid homology of ORF2 was 89.6% to 100.0%,there were 35 mutation points,large degree of variation,the only glycosylation site (NYS) was conserved.10 strains did not change significantly,mutants were not due to PCVD,PCV2b was the predominant type,and PCV2 was related with seasonality.     

禽流感病毒WUDI-H9N2株的分离鉴定及 HA基因的分子特征研究

本研究于2011年8月从山东省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行病毒血凝试验及血凝抑制试验、RT-PCR、动物回归试验等方法证实已分离到禽流感病毒(avian influenza virus,AIV) H9N2,命名为WUDI-H9N2株。根据GenBank上发表的AIV H9病毒的HA基因序列,用Oligo 6.0生物学软件设计引物,对分离株WUDI-H9N2株HA基因进行扩增、测序及序列分析。将分离的AIV H9毒株与其他血清型代表参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。WUDI-H9N2株 HA基因全序列长为1708 bp,无核苷酸的插入和缺失,cDNA包含了1个完整的开放阅读框(ORF),编码区由1683 bp组成,共编码560个氨基酸。HA序列与国内参考毒株的核苷酸序列的同源性在92.9%~98.1%之间,其中与安徽分离株A/chicken/China/AH-10-012010(H9N2)同源性为98.1%。