马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13 d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体（2n=38）占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体（Lipofectamine^TM 2000）转染绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。     

成年(黄占)鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养

本试验对1头黄占鹿的耳缘皮肤组织采用0.1%胶原酶(Ⅰ型)消化组织块法进行原代培养,反复传代纯化,获得了成纤维细胞,进行了生物学特性观察,并对各代细胞进行了常规冷冻保存。利用Photoshop软件对F12代细胞染色体进行了核型分析,结果表明该黄占鹿的染色体数目为68,常染色体中1号和7号为M染色体,其余的均为A常染色体;X染色体是最大的A染色体,Y染色体是最小的M染色体;该黄占鹿的核型式为4(M)+62(A),XY(A,M);对部分冷冻细胞进行了解冻培养,解冻存活率和贴壁率分别为61.04%、38.85%。     

早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定

为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞。结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快;用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8%)＞耳(94.7%)。2种组织成纤维细胞生长曲线均呈"S"型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h)。用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应。     

运用SNP芯片评估马身猪保种群体的遗传结构

旨在研究马身猪保种群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构.本研究利用Illumina CAUPorince 50K SNP芯片检测39头保种马身猪的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP);采用Plink软件计算最小等位基因频率、多态信息含量、观察杂合度和期望杂合度,分析保种...     

莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞系的建立

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,利用组织块法培养莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞,并对莆田黑猪猪耳皮肤成纤维细胞进行传代及冷冻.通过试验,获得能在体外正常传代培养的细胞系,为莆田黑猪克隆研究提供供核细胞来源.     

野牦牛成纤维细胞的分离培养与传代

为了提高野牦牛成纤维细胞分离培养效果,研究了组织保存方法、原代培养方法、培养液类型、添加细胞生长因子和冷冻保存液配方对野牦牛体细胞分离培养与传代的作用。结果表明,PBS、D/F12和TCM199适合野牦牛皮肤组织的保存,D/F12和TCM199培养液适合组织块培养,组织块成活率达到（86.29±4.62）%,组织块法适合野牦牛成纤维细胞的原代培养;D/F12培养液培养野牦牛成纤维细胞效果较好,群体倍增时间和平台期密度分别为38.47 h和2.075×10⁶/mL,正常二倍体核型百分率为84.33%;表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞因子（bFGF）产生了较明显的促增殖作用,平台期细胞密度明显增加;2种冷冻保存液（D/F12添加胎牛血清和二甲亚砜及胎牛血清添加二甲亚砜）均能用于野牦牛细胞冷冻,细胞存活率分别是87.33%和89.00%。     

晋中绵羊耳成纤维细胞系建立

以晋中绵羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法,通过原代培养和传代培养对细胞进行了细胞形态学观察、细胞计数和生长曲线的绘制,探讨了细胞体外培养模式.结果:细胞生长总体趋势呈“S”型;建立了晋中绵羊耳成纤维细胞系,细胞系的建立,使晋中绵羊的重要种质资源在细胞水平上保存下来.     

奶牛耳成纤维细胞的分离培养及培养条件的研究

本试验研究了奶牛耳成纤维细胞的体外培养,培养液、消化液、胰岛素和血清饥饿对细胞的影响。采用组织块贴壁法培养。了奶牛耳成纤维细胞,采用0．25％胰酶差别消化获得了纯化的奶牛耳成纤维细胞。用三种不同的培养液即DMEM（低糖）、DMEM（高糖）、DMEM／F12,对细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间均在2．3-2．5d,DMEM（高糖）的培养效果稍好。用三种不同的消化液（0．25％胰蛋白酶,0.02％EDTA,0．25％胰蛋白酶＋0．02％EDTA）对传代钿跑进行消化．结果表明0．25％胰蛋白酶＋0D2％EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高。在培养液中添加姨岛素能促进细胞的生长。对指数生长期的细胞进行血清饥饿后,细胞仍保持着较高的活力。     

撒坝猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

实验采用撒坝猪耳缘组织块贴壁培养法首次对撒坝猪成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了撒坝猪耳缘成纤维细胞系;并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行分析;还利用透射电镜观察了耳缘组织细胞。结果表明:细胞倍增时间为48 h,生长曲线为"S"型;染色体中正常二倍体染色体(2n=38)所占比例为92.56%;细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染检测均显示为阴性。透射电镜观察显示,成纤维细胞呈长梭型。     

转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。     

昆明犬胎儿成纤维细胞系的建立及生物学特性分析

本研究旨在探索和建立昆明犬胎儿成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性.试验利用剖腹手术法获得发育30 d的昆明犬胎儿12个,性别鉴定结果为7公5母.公、母胎儿体尺和体重分别为:体长1.90 cm±0.14 cm和2.00 cm±0.05 cm,体宽0.90 cm±0.13 cm和0.90 cm±0.15 cm;体重0.68 g±0.17 g和0.66 g±0.06 g,差异均不显著(P>0.05).以昆明犬胎儿组织为材料,采用胶原酶消化法和细胞冷冻保存技术建立了昆明犬胎儿成纤维细胞系,并对所构建的细胞系进行生物学特性研究.结果表明,分离的胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈S型,倍增时间约为36 h;冻存前和复苏后的存活率分别为96.1%和94.6%;染色体核型分析显示2n=78(XY),并在体外培养多代后仍能保持正常核型.本研究建立的昆明犬胎儿成纤维细胞系可在体外快速贴壁生长、增殖,进行稳定培养,这不仅使昆明犬遗传资源在细胞水平得以保存,且所获成纤维细胞能作为相关研究中所需细胞的来源.     

鸭胚成纤维细胞培养、传代及保存方法的研究

本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系,为鸭胚胎或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织,10% FBS+DEME营养液培养,获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护剂对F1代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存,检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获得高活性的鸭胚成纤维细胞,并可成功传至第三代。其中F1代与F2代细胞活力最好,达到90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异,均小于80%,其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强,生长密度保持较好。     

马身猪MEF2A基因4种可变剪接体的克隆和生物信息学分析

本研究旨在克隆马身猪肌细胞增强因子2A（myocyte enhancer factor 2A,MEF2A）基因的不同剪接体类型。依据转录组测序对可变剪接的预测结果,试验扩增MEF2A基因第5~8外显子之间的编码区,用生物信息学软件分析了马身猪MEF2A基因不同剪接体的序列特性,预测保守结构域,构建系统进化树,比对不同物种MEF2A的氨基酸同源性。结果显示,获得了4个MEF2A基因的剪接体,MEF2A1的第5~8外显子正常剪接;MEF2A2缺失了第5外显子,第6外显子的5'端多出138 bp,第7外显子的3'端多出102 bp;MEF2A3缺失了第5外显子,第6外显子的5'端多出138 bp;MEF2A4第7外显子的3'端多出102 bp。插入的138 bp序列编码的蛋白质中存在1个保守结构域HJURP_C,这可能与MEF2A参与肝细胞纤维化作用有关。MEF2A1和MEF2A4与猪MEF2A1（GenBank登录号:NP_001090890.1）同属于一个亚群,同源性高达98.9%,MEF2A2和MEF2A3与猪MEF2A2（GenBank登录号:NP_001093168.1）同属于一个亚群,同源性分别为98.2%和98.9%。本试验成功克隆了4个MEF2A基因的剪接体,为进一步研究其蛋白功能奠定基础。     

北京油鸡胚胎成纤维细胞系建立与生物学特性研究

采取组织块直接培养法，对北京油鸡胚胎组织进行原代和继代培养，成功地建立了成纤维细胞系。并对培养细胞进行了形态学、细胞生长动力学观察，以及核型和乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的同工酶分析。结果表明，该细胞系的群体倍增时间(PDT)为24h；细胞染色体中二倍体占主体，为76％～88％；乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同工酶电泳图谱与本室其它细胞系有明显差别；细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性。该细胞系的建立，使北京油鸡这一国家重要种质资源在细胞水平上保存下来，也为基因组文库和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。     

陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养

本研究建立陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养体系,采用组织块培养法可以获得陆川猪耳部成纤维细胞。用0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,能很好的支持陆川猪耳部成纤维细胞的生长。传3代后,观察到培养的细胞形态逐渐均一,为典型的成纤维细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形...     

Cloning and Bioinformatics Analysis of 4 Alternative Splice Variants of MEF2A Gene in Mashen Pig

This study was aimed to clone the different splicing variants of myocyte enhancer factor 2A (MEF2A) gene in Mashen pig. According to the prediction results of the alternative splicing in the RNA-Seq sequencing, the coding region of MEF2A gene exons 5-8 were amplified. We analyzed the sequence characteristics of different splicing variants of MEF2A gene in Mashen pig, predicted conservative structure domain, constructed phylogenetic tree and compared the homology of MEF2A amino acid in different species by bioinformatics softwares. The results showed that 4 alternative splice variants of MEF2A gene were obtained. The exons 5-8 of MEF2A1 spliced normally. MEF2A2 lacked the exon 5, and the 5'end of exon 6 was 138 bp longer, the 3'end of exon 7 was 102 bp longer. MEF2A3 lacked exon 5, and the 5'end of exon 6 was 138 bp longer. The 3'end of MEF2A4 exon 7 of was 102 bp longer. The protein, encoded by inserted 138 bp sequence, contained a conserved domain-HJURP_C, which was the result of MEF2A participating in hepatocyte fibrosis. The MEF2A1, MEF2A4 and MEF2A1 of pig submitted in GenBank (accession No.NP_001090890.1) belonged to a subgroup, homology up to 98.9%. The MEF2A2, MEF2A3 and MEF2A2 of pig submitted in GenBank (accession No.NP_001093168.1) belonged to a subgroup, the homology was 98.2% and 98.9%, respectively. The successful cloning of 4 alternative splice variants of MEF2A gene laid the foundation for further study on the function of MEF2A protein.     

德国牧羊犬成纤维细胞培养及其生长特性研究

试验旨在探讨犬耳部和腹部皮肤成纤维细胞体外培养和纯化方法,为下一步犬体细胞核移植提供基础。结果表明,在组织块培养后的4 d,耳组织周围开始有细胞出现,8~10 d呈优势生长,2周后可长满细胞瓶。腹部皮肤组织则要6~7 d方可见有细胞沿组织块周围爬出,10 d左右可以在组织块周围形成成片细胞,20 d左右可以长满整个细胞瓶。腹部皮肤成纤维细胞建系初期生长速度低于耳成纤维细胞,但传代至第4代时,两种细胞的生长曲线基本相同。     

贵德黑裘皮羊耳成纤维细胞系的建立和生物学特性的研究

以贵德黑裘皮羊耳缘组织为材料，采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻技术成功构建了成纤维细胞系，并对培养细胞进行了形态学、生长动力学观察、细胞活力测定、核型分析和微生物检测。结果表明：细胞群体倍增时间（PDT）约为36h，冻存前细胞活力为96．2％，以DMEM／F-12＋20％FBS中添加10％DMSO冻存成纤维细胞，解冻后细胞活力为93．6％，24h后的贴壁率为85％。在传代10次之前，细胞染色体中二倍体（2n=54）占主体，约为82％～90％，细菌、真菌、病毒、支原体检测为阴性。该细胞系的建立，使贵德黑裘皮羊这一国家重要种质资源在细胞水平上保存下来，也为体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。     

岷县黑裘皮羊肾组织成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

采集岷县黑裘皮羊肾组织,用胰蛋白酶热消化法制备原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法进行继代培养和细胞纯化,并对复苏细胞的形态、活力、生长曲线、荧光蛋白质粒转染表达、核型以及乳酸脱氢酶同工酶等生物学特性进行了分析。结果显示:原代和传代细胞生长形态均好,群体倍增时间为28.3 h;染色体2 n=54,二倍体占主体(84%)乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱有明显特征,未见LDH4、LDH5谱带,与其它羊有明显区别;外源性荧光蛋白转染质粒在该细胞中能进行复制和表达;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性。表明该研究已成功建立岷县黑裘皮羊肾组织成纤维细胞系,为在细胞水平上保存岷县黑裘皮羊种质资源以及进行相关研究提供了理想的生物材料。     

黄鳍鲷肝细胞体外培养研究

以黄鳍鲷肝脏细胞为材料 ,研究其肝细胞体外培养适宜的 p H、血清浓度、谷氨酰胺等条件 ,并进行传代培养试验。结果表明 ,培养液为 :MEM含 2 0 %小牛血清、15 g/ L L-谷氨酰胺及 p H 6 .9～ 7.1时 ,在 2 3℃中静置培养 ,黄鳍鲷肝细胞生长良好 ,3～ 5 d长满单层 ,细胞主要为成纤维细胞状 ,并能顺利传代。细胞动力学试验表明 :传代细胞 1～ 2代为适应期 ,3～ 5代为旺盛期 ,6代之后表现出衰老现象