猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

摘要：参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据TGEV S蛋白基因和PEDV S基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为426bp和584bp。通过对相关病毒检测,建立了TGEV和PEDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为TGEV和PEDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

上海梅山猪封闭群内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为检测分析上海梅山猪携带猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的情况,为该猪种作为器官移植供体的生物安全性提供现实依据,笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集45头猪的耳组织,并构建耳成纤维细胞系,利用PCR检测PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组DNA,利用RT-PCR的方法检测mRNA表达状况。结果发现被检测的45份样品均携带完整的3种亚型的PERV前病毒DNA;RT-PCR结果显示,45份样品中有40份同时有PERV-A和PERV-B两种亚型的表达,还有5份样品仅检测到PERV-B亚型的表达,未检测到PERV-C亚型的表达。鉴于生物安全性方面的考虑,该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商榷。     

猪细环病毒k2型福建株ORF2基因克隆

为丰富福建省猪细环病毒的分子流行病学数据,本研究根据猪细环病毒1a型、1b型和k2型特异性检测引物对临床顽固性腹泻仔猪病料组织进行PCR检测,结果从1例病料中检测到猪细环病毒k2型阳性。并通过设计猪细环病毒k2型ORF2基因特异性引物对阳性病料扩增后进行克隆测序,获得猪细环病毒k2型ORF2基因完整编码区序列。分析发现所克隆的猪细环病毒k2型福建株ORF2基因全长为203 bp,编码有67个氨基酸。本实验株ORF2基因和猪细环病毒k2型代表株德国家猪分离株2p株(Gen Bank登录号AY823991)核苷酸同源性高达97.5%;和猪细环病毒1a型(Sd_TTV31株)和1b型(1p株)代表株核苷酸同源性均低于50.0%,分别为43.9%和47.3%。从遗传进化关系上看,本实验株ORF2基因和Gen Bank中猪细环病毒k2型处于同一遗传进化分支,而猪细环病毒1a型和猪细环病毒1b型均处于其他遗传分支。本研究首次在福建猪群中检测到猪细环病毒k2型感染。     

猪流行性腹泻病毒TX株的分离鉴定及毒力分析

2011年江苏泰兴某些猪场相继发生了以腹泻为主要症状的疾病,造成大量哺乳仔猪甚至育肥猪发生死亡。对采集腹泻病料进行病毒的分离鉴定及毒力分析。首先用特异性引物对采集的病料样品进行常见猪病的PCR或RT-PCR检测,并处理病料组织进行电镜观察;腹泻病毒经1日龄未吃初乳的仔猪进行猪体复归试验,再次收取病料并进行病毒纯净性检测;最后测定了腹泻组织毒对5,15,25日龄仔猪的致病性,及对25日龄仔猪的半数致死量。结果表明:PCR与RT-PCR鉴定结果腹泻猪为猪流行性腹泻病毒感染所致,在组织中没有其他常见猪传染病病原的存在;电镜观察呈典型的PEDV冠状形态;以特异性引物扩增S1基因,分析测序结果并进行基因进化树分析表明该毒株与当前流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远,而与我国当前流行的PEDV变异株亲缘关系近;该毒株对5,15,25日龄仔猪100%致死,感染后表现腹泻、呕吐等典型的PEDV感染症状。     

辽宁省猪血凝性脑脊髓炎流行病学调查与分析

从辽宁省各地区采集猪血清样本和HEV感染疑似病例脑组织样品,进行HEV抗体和病原学检测,结果910份样品中有451份呈现HEV抗体阳性反应,阳性率为49.6%;23份疑似病料检测HEV阳性率为73.91%,多与PRRSV等病原混和感染.依据临床样本资料和检测结果综合分析表明,辽宁省各地区普遍存在HEV感染,主要为隐性感染,发病猪均为45日龄以下仔猪.通过检测猪血清HEV抗体效价,可以判断HEV感染状态,为养猪场制定相应的防制措施提供依据.     

辽宁省猪血凝性脑脊髓炎病毒抗体的血清学调查

摘要： 从辽宁省各地区采集猪血清样本,应用血凝和血凝抑制试验检测血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)抗体。结果,910份样品中有451份呈现HEV抗体阳性反应,阳性率为49.6%;抽检了10个规模化养猪场共280份样品,阳性率高达70.0%;抽查了不同年龄阶段猪血清样品,种母猪阳性率最高,为73.8%,仔猪次之,为67.5%,育肥猪最低,为37.0%。调查证明辽宁省各地区普遍存在HEV感染,被采集血清的成年猪未表现临床症状,说明HEV在本地区的猪群中主要表现为隐性感染,仔猪有少数出现症状,诊断为HEV与猪瘟或猪繁殖与呼吸综合征等混合感染。关键词：血凝性脑脊髓炎病毒;血清学调查;猪;     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离与鉴定

用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株.该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670 bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60 nm.命名该分离毒株为HN-HW株.     

猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

动物源性食品中猪源性成分检测

为探讨猪源性成分检测可行的方法,利用SYBR Green I Real time PCR对动物源性食品中猪源性成分进行测定。根据猪mtDNA保守序列设计特异性引物,对牛、羊、猪的动物源性食品进行扩增;克隆目的基因片段,并以此为标准品,优化反应条件和反应体系,提高灵敏度;反复检测不同样品,测试稳定性。结果表明SYBR Green I Real time PCR技术能够特异性的检测到动物源性食品中猪源性成分,引物特异性强、稳定性可靠,灵敏度达到1×10^-6 ng/μL,建立了动物源性食品中猪源性成分的快速、精准、经济、便捷的检测方法。     

天津郊区青椒病毒种群与CMV株系分化研究初报

1987—1988年在天津郊区青椒上发现了4种病毒:黄瓜花叶病毒(占77.0%)、烟草花叶病毒(占42.5%)、马铃薯X病毒(占63.1%)和马铃薯Y病毒(占38.1%),未发现蚕豆萎蔫病毒和苜蓿花叶病毒.根据鉴别寄主的症状反应,天津青椒上黄瓜花叶病毒可分为4类,定名为第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ株系.     

黑龙江省大豆SMV的采集与分布研究

试验根据2002年和2003年两年在黑龙江省各市县地区所采集的大豆花叶病毒病(SMV)样品所表现的症状,利用MVSP3.1.2版本的软件分别对其进行聚类分析,研究大豆花叶病毒在黑龙江省各市县地区的症状表现规律以及分布规律。　　聚类结果表明：黑龙江省的各地区SMV表现的主要症状为皱缩型,其次为黄化型的,只有极少数表现为畸形。在2003年的223份样品中有一半的样品表现为皱缩;在2002年的126份样品中有80％的样品表现为皱缩。这些说明黑龙江省的大豆花叶病毒主要以１号株系为主。　　为进一步研究黑龙江省各地区的发病情况,将黑龙江省划分为东、西、南、北四大块。分别对各部分的病毒样品的症状进行聚类分析,结果表明：各地区也基本以皱缩型SMV为主,大致规律与黑龙江省的整体发病规律相吻合。     

马铃薯上PVY、PVS和PLRV的三重RT-PCR检测

根据PVY、PVS和PLRV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列的保守区域设计各自的引物,利用三重RTPCR技术实现了在同一反应体系中同时扩增出3种病毒产物.PVY、PVS和PLRV扩增产物测序长度均与目的片段的长度相符,分别为781,181,364 bp;各种病毒产物的测序结果同GeneBank中的序列...     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

黑龙江大葱病毒病原鉴定初报

大葱病毒病普遍发生,是导致产量和品质下降的主要原因。根据大葱病毒的寄主范围、病毒粒体形态、病理超微结构等测定结果,初步鉴定侵染病原属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的暂定成员,其种子可传带病毒。     

禽用疫苗病毒浓缩技术的研究

采用FILTRON中型盒式超滤系统,分别选用截留分子量为30,50,100及300 K 4种不同孔径的超滤膜,对NDV,AIV,EDS76V,IBV及IBDV共5种病毒抗原液进行了浓缩试验研究。结果显示,这4种孔径的超滤膜均可用于上述5种病毒液的浓缩,其病毒的截留率可达99.9%~100%;采用各种病毒浓缩液、未浓缩病毒液及超滤液制成各种相应浓缩苗、未浓缩苗及超滤液乳剂免疫试验鸡。试验证明,浓缩苗明显优于未浓缩苗,在病毒浓缩过程中均未出现有效抗原成分的丢失,其抗原性也未发生变化。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR诊断犬瘟热病毒方法的建立

根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

大蒜茎尖脱毒培养及快繁技术研究

以河北省两个名优地方品种安国大蒜和永年大蒜为试材,用Ms,B5作基本培养基,研究了大蒜茎尖繁殖脱毒快繁技术。结果表明,最佳诱导培养基为B5 0.1 mg/L NAA 3 mg/L 6_BA,但是,激素、营养物质的添加数量以及培养时期不同品种间有差异;剥离大蒜茎尖带一定数量的鳞片为好,其不仅可提高脱毒苗成活率,而且有利于扩大茎尖繁殖系数。无毒蒜大田扩繁的播种时间对产量有一定影响,且品种间差异较大。     

RT-PCR检测甜菜坏死黄脉病毒及总RNA提取方法研究

为选择较为适合甜菜总RNA的提取方法,构建和优化RT有效体系。以田间甜菜叶片、根毛及根表皮为材料,研究了提取甜菜总RNA的方法以及利用RT-PCR技术进行甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的检测。研究表明,获得良好的RT-PCR扩增效果,RT体系中dNTPs浓度、引物、AMV、模板RNA的浓度要分别达到1 mmol/L,1μmol/L,0.1 U/μL,0.01μg/μL较好。PCR体系中dNTPs浓度、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2 的浓度要分别达到0.1 mmol/L,0.1μmol/L,0.01U/μL,1.48 mmol/L效果较好。RT-PCR法对BNYVV检测,可作为甜菜品种(育种材料)早期抗丛根病性鉴定的依据之一。