免疫捕捉PCR和经典PCR方法检测水稻细菌性谷枯病菌灵敏性比较

将免疫吸附富集(ISE)和经典PCR结合以提高水稻细菌性谷枯病的检测效率,并且利用多克隆抗体技术成功地获得了4种抗血清,即抗Burkholderia glumae全菌体血清ASBg14,ASBg32,ASBg26和ASBg04,ODD法测定该4种抗血清的效价均达到1∶32以上,利用凝聚法测定的所有抗血清的效价也均达到了1∶5 120 以上,通过两种方法结合测定效价均显示为合格抗体。通过对4种抗血清的专化性进行研究,结果显示ASBg14和ASBg32专化性较高,抗血清ASBg26 和ASBg04专化性不是很理想。用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测谷枯病菌,结果表明,所有谷枯病菌都能产生500 bp左右的特异性片段,非谷枯病菌的8个菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,直接PCR技术能检测到1×105 cfu·mL-1左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到103 cfu·mL-1 左右悬浮液,免疫捕捉PCR比直接PCR灵敏性提高102倍。检测人工接种的病稻种实验中,直接PCR技术能检测到2粒及以上带菌种子制得浸悬液,而免疫捕捉PCR技术仅1粒带菌种子即可。     

植物水平基因转移研究进展

水平基因转移,一般分为细胞内部或者跨越物种边界的遗传物质交流。跨界直接介导方式,包括共生、内共生、寄生、嫁接等。细胞内的基因转移,主要包括细胞核与细胞器基因组间的相互渗透;跨越物种边界的遗传物质交流,主要涉及寄生与寄主植物的基因横向转移,寄主与寄生植物mRNA也会发生大规模的水平转移。基于基因组学研究进展,本研究综述了植物水平基因转移的迁移序列类型、迁移方向及迁移机制:首先,植物细胞的线粒体基因组能够整合细胞核转座元件以及叶绿体起源的tRNA基因,线粒体和叶绿体基因组的功能基因及间区序列能够迁移到核基因组;其次,植物种间,通过寄生、嫁接等方式转移大量的DNA(如线粒体基因、叶绿体基因和转座元件)和RNA(如mRNA)序列;迁移机制涉及到DNA介导和RNA介导方式,迁移方向包括单向和双向转移。迁移序列的基因功能活性研究是重要的后续研究方向。     

基因从真核生物向原核生物水平转移的研究进展

基因水平转移（horizontal gene transfer,HGT）是生物界的普遍现象,而在已发现的 HGT 事件中基因从真核生物水平转移至原核生物的现象相对比较罕见。对目前国内外已报道的文献进行了概括与总结,综述了基因水平转移的普遍性,真核生物至细菌、蓝藻等原核生物的基因水平转移研究现状,分析此类基因转移事件频率低存在的问题,并进行了展望。     

噬菌体及其宿主终端酶序列的系统进化研究

在原核生物的进化过程中,基因的横向转移(HGT)是一个重要的进化机制.为了研究HGT在噬菌体及其宿主体内的发生情况,分析多个物种的终端酶蛋白质序列.结果显示,大部分噬菌体与其宿主间的蛋白质序列中,终端酶的大、小亚基的同源性都非常之高,小亚基的序列几乎与其宿主完全一致.相比之下,噬菌体间的蛋白质序列同源性非常低.系统发生分析显示,序列相似性高的噬菌体较容易与其宿主聚集,产生寄生关系.结果表明,在噬菌体及其选择的宿主之间存在HGT,而且这种作用可能对终端酶的进化产生重要的影响.     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

通过多基因组比较的方法在5种绿球蓝细菌中识别基因组岛(英文)

为探索水平基因转移在绿球蓝细菌基因组多样性中的作用,5个高光适应性绿球蓝细菌基因组被比较.先用BLASTP两两最佳匹配搜索和基因位置保守性的方法预测直系同源基因,并进一步计算每个基因组中所有基因在其他4种绿球蓝细菌基因组中直系同源基因的数量,从而达到识别外源基因的目的;而基因组岛是指由1个或几个连续外源基因组成的区域.结果表明:在5个绿球蓝细菌基因组中共识别出了16至52个不等的基因组岛,它们中的许多基因在病毒基因组或富含病毒的环境样本中都有同源基因.以上这些结果显示,在绿球蓝细菌中,病毒可能介导了基因的水平转移,从而导致了基因组的多样性.     

Up-regulation of a homeodomain-leucine zipper gene HD-1 contributes to trichome initiation and development in cotton

Plant trichomes originate from epidermal cells. In this work, we demonstrated that a homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) gene, Gh_A06G1283 (GhHD-1A), was related to the leaf trichome trait in allotetraploid cotton and could be a candidate gene for the T₁ locus. The ortholog of GhHD-1A in the hairless accession Gossypium barbadense cv. Hai7124 was interrupted by a long terminal repeat (LTR) retrotransposon, while GhHD-1A worked well in the hairy accession Gossypium hirsutum acc. T586. Sequence and phylogenetic analysis showed that GhHD-1A belonged to the HD-Zip IV gene family, which mainly regulated epidermis hair development in plants. Silencing of GhHD-1A and its homoeologs GhHD-1D in allotetraploid T586 and Hai7124 could significantly reduce the density of leaf hairs and affect the expression levels of other genes related to leaf trichome formation. Further analysis found that GhHD-1A mainly regulated trichome initiation on the upper epidermal hairs of leaves in cotton, while the up-regulated expression of GhHD-1A in different organs/tissues also altered epidermal trichome development. This study not only helps to unravel the important roles of GhHD-1A in regulating trichome initiation in cotton, but also provides a reference for exploring the different forms of trichome development in plants.     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

有毒有机物影响DNA酶解和抗生素抗性基因横向迁移

进入环境中的有毒有机物种类较多、分布广泛。大量生命遗传物质DNA与有毒有机物共存于污染环境中,由于抗生素滥用,一些DNA上携带着抗生素抗性基因(ARGs);有毒有机物和ARGs复合污染严重危害着生态安全和人群健康。有毒有机物如何影响DNA酶解和ARGs迁移,这已成为环境领域研究的热点之一,近些年来,该领域研究取得一些重要进展。有毒有机物可通过共价作用、非共价作用、剪切作用与DNA结合,进而改变DNA分子结构、影响DNA酶解;有毒有机物也可通过改变DNA降解酶活性或占据DNA上降解酶的酶切位点,进而影响DNA酶解过程。环境中ARGs横向迁移主要有接合、转导、转化三种方式,有毒有机物影响ARGs横向迁移的机制主要包括:有毒有机物调控可动遗传因子、引起细胞SOS反应、胁迫细胞形成自然感受态、影响生物膜形成、改变细胞膜通透性、与胞外质粒形成加合物。进入细胞后的有毒有机物如何作用于ARGs的复制和表达,这应是未来深化有毒有机物影响ARGs横向迁移机制的一个关键所在。     

EIAV基因转移载体转录后调控元件的优化

【目的】为了提高马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体质粒pcPPTPRE(+)的外源蛋白表达能力,对其转录后调控元件进行优化。【方法】将PCR扩增土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV)转录后调控元件(WPRE),克隆于pGM-T载体获得重组质粒pGM-WPRE,利用NotⅠ酶将WPRE亚克隆入pcPPTPRE(+),筛选WPRE正向连接的重组质粒pcPPTWPRE,采用磷酸钙法分别将pcPPTWPRE和pcPPTPRE(+)转染HEK293细胞和DF-1细胞,利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达,利用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP阳性细胞的表达率。【结果】在HEK293细胞中,pcPPTWPRE表达外源基因的能力极显著优于pcPPTPRE(+);在DF-1细胞中,pcPPTWPRE与pcPPTPRE(+)表达外源基因的能力均不强,但前者略优于后者。【结论】土拨鼠肝炎病毒转录后,调控元件(WPRE)可以明显增强EIAV载体质粒的外源蛋白表达能力,为高表达能力伪型EIAV重组病毒的获得奠定了基础,同时也为其他病毒载体的构建提供了借鉴。     

苏丹6区原油管道尼罗河定向钻穿越技术

介绍了苏丹6区外输管道尼罗河定向钻干线穿越施工技术,对管道穿越施工中出现的问题从工程地质概况、管道穿越线路、管道的承压能力、地下打孔的孔径以及施工等方面进行了分析,提出了解决的办法,并对今后的类似工程提出了建议.     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

对我国农村剩余劳动力转移的重新审视

农村剩余劳动力转移是为了实现农村经济有效发展;农村经济及我国整体经济的发展必然影响农村劳动力转移。组织农村剩余劳动力转移应与促进农村经济发展、壮大农业经济同步进行。     

陕西扶风某生猪养殖场肠球菌分型与毒力基因检测

【目的】分析分离自陕西扶风某生猪养殖场的肠球菌的亚型及毒力基因携带情况,为保障猪肉食品安全和临床感染治疗提供依据。【方法】采用PCR方法,对从陕西省扶风县某养殖场生猪鼻腔、粪便及其养殖场环境样品中分离到的87株肠球菌进行粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）特异性基因的扩增,根据凝胶成像中条带位置对其进行分型,检测其ace、cylA、cylB、cylM、cylL1、efaA、esp、gelE、AS、asal和hyl等11种毒力基因的携带情况。【结果】87株肠球菌中,粪肠球菌、屎肠球菌、鸡肠球菌和其他类型肠球菌（Other Enterococcus）的检出率分别为57.5%,10.3%,4.6%和27.6%;5种毒力基因asal、gelE、cylL1、ace和esp的平均检出率分别为50.6%,27.6%,19.5%,18.4%和1.2%,在猪舍地面菌株中均有检出。粪肠球菌中的asal检出率显著高于其他4种毒力基因（P<0.05）,各毒力基因在未定型的其他亚型肠球菌中的检出率无显著差异（P>0.05）。在生猪育肥前期和后期,所有源菌株中毒力基因ace、cylL1、esp、gelE和asal的总检出率分别为93.7%和6.3%,82.3%和17.7%,100.0%和0%,75.0%和25.0%及84.1%和15.9%。【结论】扶风县某生猪养殖场中流行的肠球菌主要为粪肠球菌,其次为屎肠球菌和鸡肠球菌。不同来源菌株中毒力基因检出率不同,生猪育肥后期菌株中各毒力基因的检出率均有所降低。     

氨氮对牛粪厌氧消化中四环素类抗性基因丰度及其驱动因子的影响

为探究氨氮浓度对高温厌氧消化中四环素类抗生素抗性基因（Tetracycline resistance genes,TRGs）绝对丰度变化及其微生态机制,设置氨氮浓度为600、1 100 mg·L^-1和1 600 mg·L^-1的牛粪高温厌氧消化体系,分析了TRGs、可移动遗传元件和细菌群落结构的变化特征及三者之间的关系。结果表明：氨氮浓度为600 mg·L^-1和1 100 mg·L^-1时,高温厌氧消化的产气速率和总产气量相似;氨氮浓度为1 600 mg·L^-1时,二者均受到抑制。tetC、tetO、tetQ、tetT和tetX的丰度在不同氨氮浓度条件下均减少,但tetA和tetG的丰度在氨氮浓度为1 600 mg·L^-1条件下增加了1.05倍和1.85倍。不同处理中细菌群落差异明显,TRGs潜在宿主菌的种类和数目均改变。相关性分析表明TRGs潜在宿主菌的差异可一定程度解释TRGs的丰度变化,但tetA和tetG丰度在氨氮浓度为1 600mg·L^-1条件下的增加主要与intI1和intI2的增长有关。综上所述,牛粪中较高的氨氮浓度会增加高温厌氧消化过程中TRGs通过水平基因转移途径增殖的可能性,从而增加TRGs传播的风险。     

土壤Zn向白菜茎叶的转移能力

研究了采自福建不同地区的 26个土壤的Zn向白菜茎叶的转移能力.结果表明,虽然用DTPA提取的有效Zn与茎叶Zn含量之间无显著相关,但以DTPA有效Zn为基础的Zn转移系数与土壤有效Zn之间呈极显著的幂函数相关,这种幂函数相关将白菜茎叶Zn含量与土壤有效Zn联系起来.在土壤Zn与作物Zn含量无显著相关的情况下,可用Zn转移系数(DTPA基)与土壤有效Zn之间的幂函数关系估计土壤Zn的环境质量限量.     

黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH克隆及表达

通过Solexa技术和比较基因组学方法鉴定霜霉威胁迫下黄瓜果实差异表达基因,筛选黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH。研究利用PCR克隆获得SDH基因全长,命名为Cs SDH。构建亚细胞定位表达载体,利用农杆菌浸润法注射烟草叶片后激光共聚焦显微镜下观察;分别用荧光定量RT-PCR方法和酶联免疫法研究高、低农残品系D9320和D0351中Cs SDH基因在农药霜霉威处理后,不同时间点、不同组织部位时空表达特征和琥珀酸脱氢酶活性。结果表明,Cs SDH基因在烟草叶片细胞中被定位在细胞膜上。黄瓜低农残品种D0351中,Cs SDH基因在果实受霜霉威胁迫后反应迅速,主要在处理前期响应表达强烈,琥珀酸脱氢酶活性显著增加,且该基因表达量显著高于其在高农残品种D9320中表达量。Cs SDH果、叶中表达量较茎中高,且各组织部位表达量高低顺序稳定,为叶果茎。黄瓜高农残品种D9320中,Cs SDH基因表达量在0.5、1、3、12 h呈现上调表达,6、9 h基因表达量差异不显著,48 h出现上调表达高峰。说明克隆得到的Cs SDH基因属农药处理前期响应基因,且该基因可能在降低黄瓜农药残留过程中发挥重要作用。试验通过研究黄瓜琥珀酸脱氢酶基因(SDH)在霜霉威胁迫下表达情况,为挖掘黄瓜低农药残留性功能基因以及探明其作用分子机制奠定基础。     

体外免疫法制备乙肝病毒特异性转移因子的工艺研究

目的：优化体外免疫法制备乙肝病毒特异性转移因子的工艺。方法;采用猪脾细胞与植物血凝素、乙肝疫苗共同培养,收集致敏细胞在组织捣碎机中破碎,用蒸馏水1：1稀释,-25℃反复冻融6次,自来水融化后装入透析袋中,用1：4的蒸馏水作透析外液,于4℃透析48h,透析液即为乙肝病毒特异性转移因子（HBV-STF）。结果：本品为黄色澄明液体,多肽含量0.493g／L,核糖含量0.372g／L,蛋白质反应阴性,紫外光谱在253nm有最大吸收,E260／E280=2.47。最佳PHA剂量为100mg／L,最佳乙肝疫苗剂量为20μg／L。结论：用体外免疫法制备乙肝病毒特异性转移因子工艺稳定,制备的转移因子符合质量标准,具有对乙肝病毒抗原的特异性。     

利用基因聚合技术改良一个优质水稻不育系的稻瘟病抗性

以抗稻瘟病水稻材料金山B-1抗病近等基因系05AMA59(携有稻瘟病抗性基因Pi-1)、05AMA71(携有稻瘟病抗性基因Pi-9)为抗性供体亲本,通过分子标记辅助回交和聚合杂交,将Pi-1、Pi-9基因导入花紫A(B)中,并在选择加代过程中改良其稻瘟病抗性.(1)遗传背景分析表明,Pi-1和Pi-9基因已成功导入新育成的不育系益农A(B)中,其遗传背景基本恢复为轮回亲本花紫A(B)的遗传背景;(2)益农A(B)的室内和田间自然诱发鉴定均表现抗病,抗性水平和抗谱均明显高于感病对照花紫A(B);(3)益农A与原来的花紫A在生育期、株高、穗粒数等重要农艺性状以及柱头外露率、异交结实率等方面均相似,益农A与花紫A所配的杂种一代在产量、株高、生育期等主要农艺性状上也相近,表明益农A保留了花紫A配合力高、米质优、异交率高等优良特性.