胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。     

苎麻EST-SSR引物开发和高多态性位点分析

根据NCBI数据库中苎麻表达序列标签EST数据设计7对EST-SSR引物,筛选出2对多态性引物,增加SSR的可用引物数量,进一步完善SSR分子标记体系;采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因分型和测序等3种方法,分析苎麻2个高多态微卫星位点。结果表明:一个微卫星不仅有重复单元次数的变化,而且其两翼也存在简单序列变异,包括核苷酸插入、删除和碱基替换;另一个复合型微卫星各组分均存在碱基增加或删除和碱基置换。根据该位点序列的高变异性,将其作为SNP分子标记,用于苎麻系统发育关系及居群遗传学研究。     

基于白木香ESTs的沉香属SSR分子标记引物筛选

通过对白木香样品的454GS FLX Titanium高通量测序,获取了大量白木香EST序列,从中搜索出956个SSR,根据引物设计标准,设计了44对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,以海南白木香样品的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有22对EST-SSR引物能较好地扩增出产物。在沉香属3个种9份样品中进一步对这些可扩增的引物进行多态性初步验证,所筛选引物均可在所有沉香属样品中使用,为后续白木香居群及沉香属植物遗传多样性分析奠定基础。     

基于白木香ESTs的沉香属SSR分子标记引物筛选

通过对白木香样品的454GS FLX Titanium高通量测序,获取了大量白木香EST序列,从中搜索出956个SSR,根据引物设计标准,设计了44对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,以海南白木香样品的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有22对EST-SSR引物能较好地扩增出产物。在沉香属3个种9份样品中进一步对这些可扩增的引物进行多态性初步验证,所筛选引物均可在所有沉香属样品中使用,为后续白木香居群及沉香属植物遗传多样性分析奠定基础。     

桂花EST-SSR引物开发及在品种鉴定中的应用

利用L₁₆（45）正交实验设计,针对模板DNA,镁离子（Mg2+）,dNTPs,TaqDNA酶和引物5个因素进行正交优化,建立适用于桂花Osmanthus fragrans表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）的最优扩增反应体系,将其用于桂花转录组EST-SSR多态性引物的筛选,最后利用筛选得到的多态性引物和聚类分析对14份四川省常见的栽培丹桂（SC01~SC14）样本进行品种鉴定。结果表明:桂花EST-SSR最优反应体系包含40 ng模板DNA,2.25 mmol·L-1 Mg2+,0.3 μmol·L-1引物,0.3 mmol·L-1 dNTPs,1.25×16.67 nkat TaqDNA聚合酶,10×PCR Buffer缓冲液2 μL,双蒸水补至20 μL;从150对EST-SSR引物中筛选得到了19对稳定性好、多态性高的SSR引物,多态性从高到低依次为五核苷酸（25.00%）,六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%）重复类型。利用筛选得到的3对高度多态性SSR引物（OF8623-1677,OF24299-844和OF28774-2088）对四川省成都市周边常见栽培的14份丹桂（Aurantiacus group）样本进行了有效鉴定。结果表明:14份样本中,有12份可判定为‘朱砂丹桂’‘Zhusha Dangui’,SC06为‘堰红桂’‘Yanhong Gui’,SC08与‘满条红’‘Mantiao Hong’和‘状元红’‘Zhuangyuan Hong’亲缘关系较近。本研究也为今后利用EST-SSR标记对桂花指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种及品种鉴定与保护等工作奠定基础。     

基于转录组测序的花椒属物种EST-SSR标记开发

【目的】开发适用于花椒(Zanthoxylum bungeanum)和竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)的EST-SSR引物,为花椒属物种的鉴定及遗传多样性探究提供分子标记。【方法】对花椒和竹叶花椒分别进行转录组测序(RNA-seq),基于得到的EST序列开发SSR引物。在2种花椒的EST-SSR引物中分别随机挑选60对引物,用12份材料(4份花椒和8份竹叶花椒)为样本,利用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性。从有特异性条带的引物中,再随机选取花椒和竹叶花椒SSR引物各15对,选取6个(2份花椒和4份竹叶花椒)样本,利用聚丙烯酰胺银染电泳进行多态性检测。【结果】花椒共有64 944条Unigene,碱基对长度共54 073 890bp,含有12 746个SSR位点,分布在10 595条Unigene上,SSR位点出现频率为19.63%,平均分布距离4.24kb。竹叶花椒Unigene共75 669条,碱基对长度58 975 053bp,共15 096个SSR位点,分布在12 612条Unigene上。SSR位点出现频率为19.95%,平均分布距离为3.91kb。60对花椒引物中,有46对成功扩增出特异性条带,扩增效率76.67%;60对竹叶花椒引物中,有41对扩增出特异性条带,扩增效率68.33%。花椒和竹叶花椒的特异性条带大小在100～300bp,主要集中在150～250bp。多态性验证试验中,15对花椒引物中有12对产生了多态性条带,多态率80.00%;15对竹叶花椒引物中则有14对产生了多态性条带,多态率93.33%。【结论】基于花椒和竹叶花椒转录组高通量测序结果开发的EST-SSR分子标记引物,具有较明显的特异性和多态性。     

长豇豆SSR有效引物的筛选与反应程序的确定

对长豇豆有效SSR引物进行了筛选,共有13对引物能对长豇豆基因组进行有效扩增,并分别确定了其适合的PCR反应程序.还对长豇豆SSR引物数量及豇豆中开发的SSR引物在长豇豆中的适用性进行了讨论.为利用SSR分子标记分析长豇豆遗传关系奠定了基础.     

女贞ISSR分子标记的引物筛选

利用60个ISSR引物，对来自不同地域的12份女贞种质材料进行PCR扩增，筛选出12个多态性丰富、条带清晰且重复性良好的、适合于所有女贞种质材料进行ISSR分析的有效引物。筛选出的12个有效引物对12份女贞种质材料进行ISSR—PCR扩增，均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱，共扩增出228条DNA谱带，其中210条为多态性带，占总扩增带数的92．1％，平均每个引物扩增出19条谱带。本试验筛选的12条引物可以有效地应用于女贞种质资源材料的ISSR分析。     

亚麻EST-SSR标记开发

为了进一步开发利用现有亚麻EST-SSR资源,从NCBI公共数据库下载7 947条亚麻EST,去除低质量和冗余序列后,筛选得到含有SSR的序列共239条,检出率为3.0%。其中二核苷酸重复49条,共7个重复类型;三核苷酸重复160条,共41个重复类型;四核苷酸重复30条,共11个重复类型。根据不同的重复类型共设计65对EST-SSR引物,在20份材料PCR扩增检测结果表明,有52对引物有目的扩增产物,其中32对扩增条带清晰且具有多态性,占设计引物的49.2%,通过聚类分析可将20份亚麻材料划分为五大类,验证了EST-SSR分子标记在亚麻遗传多样性分析中应用的可行性。     

栽培种花生EST-SSR引物的开发及应用

从高油抗青枯病花生新品系"06-4104"构建的5个cDNA文库获得了63207条EST,经序列拼接,获得14547条Uni-EST。经MISA检索,在这些Uni-EST中共检测出2643个SSR位点,分布于2250条EST中,发生频率为15.5%,平均每3.1kbEST序列含有一个SSR位点。其中,三核苷酸重复类型出现频率最高,占SSR总数的49.1%,其次是二核苷酸重复类型,占SSR总数的45.8%。在发现的46类重复基序中,AG/TC重复基序的频率最高,AAG/TTC次之。利用Primer3从含有SSR的2250条EST中共设计引物100对,利用这些引物检测花生栽培品种的多态性。结果表明,在所设计的100对引物中有91对在供试的6个花生栽培品种中得到有效扩增,其中13对得到了多态性的扩增产物,每对引物检测出的等位基因数2～3个,平均2.2个。     

辣椒EST-SSR标记的开发与应用

通过对数据库中32 295条非冗余的辣椒EST序列进行搜索,发现3 396个SSR分布于3 277条EST序列中,EST-SSR频率为10.52%,平均分布距离为4.46 kb.在辣椒EST-SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复基元占主导地位,分别占总SSR的43.02%和37.84%.优势重复基元为GA/TC、AG/CT和AT,分别占15.99%、11.98%和11.37%.用Primer Premier 5.0软件设计了420对引物,对辣椒抗疫病自交系‘B072’和感疫病自交系‘B088’进行PCR扩增,403对引物有扩增产物,引物有效扩增率为95.96%,其中76对引物有多态性,多态性引物占可扩增引物的18.86%.试验证明,利用辣椒EST序列开发SSR标记是可行的.     

小麦EST-SSR标记的开发和遗传作图

【目的】利用小麦EST序列数据库开发EST-SSR标记。【方法】对GenBank/dbEST注册的普通小麦EST序列(2006.4.18—2007.2.4)进行SSR查找,采用Primer5.0软件设计EST-SSR引物,选用3个小麦品种进行有效性检测,利用RIL群体和Mapmaker/Exp3.0软件进行遗传作图。【结果】在265362条普通小麦EST序列中,共发现6314个SSR,占整个EST数据库的2.38%。其中二核苷酸、三核苷酸重复序列最多,分别为2237(35.43%)和2084(33.01%)个。二核苷酸重复中,以GA/CT和AG/TC出现频率最高、分别占SSR总数的17.85%和10.37%,其次是CA/GT(4.07%)和AC/TG(2.53%);三核苷酸重复中,CAA/GTT(3.93%)、CGG/GCC(3.83%)、CGC/GCG(3.36%)、GGC/CCG(3.14%)、CTT/GAA(2.53%)、TGC/ACG(2.27%)以较高的频率出现。根据筛选得到的微卫星序列共设计了596个EST-SSR引物对,选择其中95分以上的194个合成。PCR检测表明,165个引物对(85%)可以扩增出稳定清晰的带型;在RIL群体中检测到21个EST-SSR引物26个位点有多态性,将其中的23个位点整合到已有的小麦遗传图谱上。【结论】开发了165个小麦EST-SSR新标记,EST序列是小麦SSR标记的重要来源。     

核果类果树EST SSR标记研究进展

介绍了EST SSR分子标记的原理和特点,并且对EST SSR技术在核果类果树分析资源、构建遗传图谱、挖掘基因、比较作图等方面的研究进展进行综述。     

高羊茅EST-SSR标记的开发及品种鉴定

利用EST-SSR分子标记对11份高羊茅（Festuca arundinacea）材料进行了品种鉴定研究。在优化DNA提取方法、扩增体系的基础上对50对EST-SSR引物进行筛选,结果表明：有42对引物可以在高羊茅上得到有效扩增,对11份高羊茅品种的鉴定结果表明,其中12对引物具有良好的多态性,占28.6%;共检测到86个等位基因,平均每个位点的等位基因数为4.5个,变幅为3-12。从谱带类型上看：S3和S44引物扩增的谱带类型最少（2种）,多态性百分率最低,为18.2%;S11引物扩增的谱带类型最多（9种）,多态性百分率最高,为81.8%;共扩增到多态性谱带65种,平均多态百分率为59.1%。     

北美鹅掌楸EST-SSR跨属间通用性

利用从北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera Linn.)EST序列中开发的176对SSR引物,以国内木兰科10属43种的DNA样品为材料,检测了该批引物在木兰科各属间的通用性.132对引物在北美鹅掌楸中有效扩增,108对在鹅掌楸(L. chinense Sarg.)中有扩增产物,在鹅掌楸属内的通用...     

大白菜EST—SSR标记开发中非SSR标记的鉴别

EST—SSR标记开发过程中经常会遇到一些问题,例如引物重复设计等。本试验对从大白菜EST序列中开发的30个多态性SSR标记产生的多态性条带进行测序,结果发现有一些标记的多态性并不是由于其所含有的简单重复序列重复次数的改变引起的,这类标记约占鉴定标记总数的13％。这些标记实际上属于EST—SCAR标记。在进行SSR变异对基因表达及功能影响方面的研究时,这类非SSR标记应该被排除。     

Development of Soybean EST-SSR Markers and Their Use to Assess Genetic Diversity in the Subgenus Soja

Developing expressed sequence tag-derived SSR （EST-SSR） markers is imperative in genetic research. In this paper, we reported 37 EST-SSR markers which were developed from 286 unigenes obtained from soybean cDNA library. Among the 286 markers designed for the 4 accessions of Glycine max and 6 of its wild progenitor （G. soja） within the subgenus Soja, 209 markers amplified DNA fragments, taking 73.1% and 37 markers appeared to be polymorphic, which was 12.9% of the total. The 37 loci detected a total of 142 alleles, while the PIC values varied from 0.194 to 0.794. Both the number of alleles per locus and PIC value were significantly related to the SSR motif. Six EST-SSR loci may be fixed for different alleles between G. max and G. soja since they were particularly polymorphic among the 6 G. soja accessions. A neighbor-joining tree placed the G. max accessions together as a group within the G. soja, though the average genetic distance among G. soja accessions was much higher. These new EST-SSRs markers will be useful for genetic diversity analysis, genetic mapping construction and gene discovery in Soja subgenus.     

交链格孢菌EST-SSR信息分析与分子标记通用性评价

为了弄清交链格孢菌(Alternaria alternata) EST数据库中的SSR信息资源,并开发可用于研究近缘种细极链格孢(Alternaria tenuissima)遗传多样性的EST-SSR分子标记。从NCBI数据库下载A.alternata表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)共727条,经过研究分析发现,A.alternata EST中SSR含量非常丰富,每5.343 kb含有1个SSR位点。根据SSR两端保守序列,设计合成13对EST-SSR引物,对来自新疆不同地区不同寄主的38株A.tenuissima进行通用性检测。检测结果显示共有5对引物能扩增出多态性条带,扩增多态率为55.56%。因此,基于A.alternata EST数据库开发的SSR分子标记,在开展近缘种A.tenuissima遗传多样性研究时具有较好的通用性。     

基于EST-SSR的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系

[目的]通过对福建地区茶树资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,为今后茶树亲本选择或遗传改良等提供依据.[方法]利用中国农业科学院茶叶研究所茶树分子生物学实验室新开发的23对和他人3对共26对EST-SSR引物对福建省的42份茶树种质资源进行PCR扩增,在所得相似系数的基础上进行UPGMA聚类,并绘制亲缘关系树状聚类图.[结果]26对引物共检测到等位位点86个,每个引物为2～5个,平均3.31个;遗传多态性信息含量(PIC)在0.05～0.75,平均值为0.56.期望杂合度(He)大小在0.02～0.81,平均值为0.60;观测杂合度(He)在0.02～0.97,平均值为0.55;群体内的Shannon指数为1.16.按相似系数为0.40可将参试的42份种质资源分为两大类.[结论]研究发现福建地区茶树资源具有相对较高的遗传多样性,并明确了不同资源间的亲缘关系.