1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据已经发表的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因序列,设计1对特异性引物(上下游分别插入Bam H I和Sac I酶切位点),利用PCR技术扩增出VP1基因,经Bam H I和Sac I双酶切后,将其克隆至原核表达载体p ET-32a上,获得重组表达质粒p ET-VP1。重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),重组蛋白经IPTG诱导成功表达。将重组蛋白切胶免疫6周龄的BALB/c小鼠,3次免疫后采血,制备DHV-Ⅰ的多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,成功表达出的重组蛋白分子量约为46 000。Western-blotting分析结果表明,该重组蛋白可与His组氨酸鼠单克隆抗体发生特异性反应,Western-blotting检测抗鼠DHV多抗的结果显示,DHV多抗能与目的蛋白发生特异性反应。以上结果表明,DHV的VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的DHV多抗能用于VP1蛋白表达的检测。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测

利用杆状病毒表达系统进行Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表达研究。首先通过PCR方法扩增出3C基因,亚克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,获得重组转座载体p FB-3C,随后将该重组质粒转化感受态细胞DH10Bac进行同源重组,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,获得重组杆状病毒穿梭质粒r Bacmid-3C,将其在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac-3C,并进行重组蛋白表达的检测。间接免疫荧光结果,鸭抗全病毒阳性血清能够与重组蛋白发生特异性结合。结果表明,DHAV-Ⅰ3C蛋白在sf9昆虫细胞中获得了成功表达。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

鸭新城疫病毒NP基因的原核表达与多抗的制备

根据鸭新城疫病毒NP基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出NP基因,克隆入原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),在IPTG的诱导下融合蛋白获得了成功表达,SDSPAGE结果显示表达的融合蛋白分子量约为59kD,Western blotting分析表明该重组融合蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析显示制备的多抗血清能够与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,NP基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于NP蛋白的检测。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的原核表达及其抗原性

参考GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)全基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增了DHV-ⅠVP3基因,将VP3基因与pET-28a(+)表达载体连接后,转化宿主BL21(DE3),用0.1 mmol·L-1的IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。电泳结果表明,VP3在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为27 kD。免疫印迹试验表明Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型基因片段的原核表达及单克隆抗体的制备

根据Genebank上已报道的鸭肝炎病毒Ⅰ型基因的全长序列,设计了1对引物,通过RT-PCR方法扩增出特异的DHV-Ⅰ基因片段;将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌Rosetta-gami(DE3),并用IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,获得了表观分子量在20kD左右的融合表达蛋白;将表达纯化后的蛋白作为抗原,免疫BALB/c健康小鼠,筛选和制备了1株DHV-Ⅰ单克隆抗体细胞株。Western-blot及ELISA分析表明:表达的重组蛋白均能与鸭DHV-Ⅰ阳性血清和制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体产生反应。同时,制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体除了能与重组蛋白反应,还能识别天然的DHV-Ⅰ病毒蛋白。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备(

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

甲型鸭肝炎病毒2A蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从甲型鸭肝炎病毒ZJ-V株的RNA模板中扩增出2A基因,将其克隆到表达载体pET-30(+)中,经酶切和测序鉴定后转化表达宿主菌BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导表达His-DHAV-2A融合蛋白.结果表明:目的蛋白在1mmol/L IPTG诱导4h的情况下以可溶性形式表达.表达产物经Ni柱纯化后获得了高纯度的融合蛋白.以纯化后的His-DHAV-2A融合蛋白为抗原免疫白兔制备多抗,Western-blot试验表明制备的多抗可与目的蛋白发生特异性反应.以上结果说明,DHAV的2A蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多抗血清可用于2A蛋白的表达检测.     

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP35'端截短基因的原核表达

<正>鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitit,DVH)是一种由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)感染导致的急性和高度致死性传染病,可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎,有的可能腹泻,病死率高达100%,是严重危害养鸭业的疫病之一。DHV主要包括3个血清型,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。3个血清型有明显的差异,无交叉免疫性。目前中国发生和流行的主要是Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-     

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。     

鸭补体C3d基因cDNA的克隆、鉴定及原核表达

补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体c3的最终裂解产物。利用RT—PCR技术从鸭肝脏总RNA中扩增出C3dcDNA,克隆测序证实所得为C3d基因。然后将其连接至表达载体PGEX-6P-1,转化人E．coli BL21并用IPTG诱导表达。SDS—PAGE分析表明目的蛋白得到高效表达,Western—blotting进一步证实目的蛋白为C3d。本研究可为开发利用鸭C3d奠定基础。     

鸭补体C3d基因eDNA的克隆、鉴定及原核表达

补体C3d是补体系统(Complement system,CS)中补体C3的最终裂解产物.利用RT-PCR技术从鸭肝脏总RNA中扩增出C3d eDNA,克隆测序证实所得为C3d基因.然后将其连接至表达载体PGEX-6P-1,转化人E. coliBL21并用IPIG诱导表达.SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到高效表达,Western-blotting进一步证实目的蛋白为C3d.本研究可为开发利用鸭C3d莫定基础.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增DHV-I(A66株)VP1基因。用限制性内切酶EcoRⅠ/HindⅢ消化VP1基因和转移载体pFastbacⅠ,在T4DNA连接酶作用下将二者连接构建转移质粒pFastbac-VP1。经PCR、双酶切及测序鉴定后将其转化至含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10bac中,蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP1,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf 9,获得重组杆状病毒rvBac-VP1。SDS-PAGE分析结果表明,VP1基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物分子量约为2.7×104。Western-blot检测结果表明,表达产物能与抗DHV-I阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.