苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆

利用特异引物从基因组BAC文库筛选到1个35 kb的片段,对该片段测序比对分析发现可能含有p26的复制区.为了验证该片段中是否含有p26的复制区,首先,将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304用EcoR I酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后自连,获得复制子克隆载体pHT304E;随后,将12 kbEcoR I片段亚克...     

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。     

酿酒酵母 ERG6基因缺失突变株的构建

设计含有与ERG6基因两侧序列同源的长引物,以质粒pBlue-Kan为模板进行PCR扩增,构建含有Cre/lox P系统的酿酒酵母ERG6基因敲除组件.将基因敲除组件转化至酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)AD1-8,通过同源重组的方式使目的基因缺失,获得为lox P-Kan-lox P序列组件所替换而产生Kanr的阳性克隆子.然后再将质粒pHis-Cre转入阳性克隆子表达Cre重组酶敲除筛选标记,成功获得酿酒酵母ERG6基因缺失的突变株,并命名为AD1-8-δ.     

转运真核表达盒的重组T7噬菌体构建

为了构建转运真核表达盒的重组T7噬菌体,并分别在体外、体内条件下检测其标签蛋白质EGFP的表达。以T7噬菌体基因组左侧578 bp处为插入位点,取上游400 bp和下游200 bp片段作为左右同源臂,并在其中插入表达EGFP基因的真核表达盒(EEB),构建同源重组质粒p UC-L-EEB-R。将该质粒载体转化T7噬菌体宿主细菌BL21,在噬菌体繁殖过程中完成同源重组,PCR筛选重组T7-EEB噬菌体。提取该重组噬菌体基因组转染Vero细胞后体外检测EGFP蛋白质表达,纯化的噬菌体免疫小鼠后体内检测EGFP蛋白质表达。结果显示,通过同源重组方法成功构建了携带真核表达盒的重组T7噬菌体,PCR检测和酶切鉴定均证明表达盒已正确插入。T7-EEB基因组转染真核细胞可见明显的EGFP蛋白质表达,免疫小鼠后活体荧光检测到EGFP蛋白质信号,在小鼠肝脏、脾脏组织中RT-PCR检测到EGFP基因的mRNA转录。表明同源重组方法可以用于构建重组T7噬菌体,噬菌体能够转运真核表达盒并实现蛋白质表达。     

基于酵母同源重组的转录因子活性分析

转录因子的转录激活验证是分析其转录活性的有效手段之一。黄曲霉菌bZIP5基因广泛参与该菌的生长发育,因此拟进行该转录因子的体外活性检测,以pGBKT7为骨架载体,采用酵母同源重组法构建载体,与体外重组酶法进行比较,并考察不同长度同源序列对酵母同源重组法构建载体的影响。结果表明：采用外源重组酶法构建载体pGBKT7-bZIP5,需要经过片段的体外重组连接、转化大肠杆菌,再提取质粒转化酵母AH109进行激活验证;而酵母同源重组法只需将线性化载体和片段一起转化酵母AH109,载体构建与激活验证同步完成,且21 ~ 30 bp不同长度的同源序列对酵母同源重组法构建载体没有影响,目的基因bZIP5均显示有自激活能力,故基于酵母同源重组的载体构建方法可行。该方法无需提供外源重组酶,为基于酵母的载体构建提供了便捷的途径。     

酵母耐铜基因CUP1改良荧光假单胞菌耐铜性研究初报

利用根际促生菌(PGPR)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等微生物的生物修复作用可治理土壤重金属污染。酿酒酵母耐铜基因CUP1编码铜金属硫蛋白(Cu-MT),对铜有很高的亲和性,可拮抗重金属铜毒性。为提高荧光假单胞菌的生物修复能力,将酿酒酵母耐铜基因CUP1克隆至荧光假单胞菌。通过引物设计,将SD序列添加至酵母耐铜基因CUP1编码序列前端,PCR扩增得到约200bp的CUP1片段,克隆至测序载体pUC19,经测序证明正确后,胶回收CUP1片段连接到具有广泛宿主范围的柯斯质粒pLAFR3上,经三亲接合转移至荧光假单胞菌AS1.1381,得到重组菌株AS1.1381/pL3CUP1。铜实验表明,重组菌株AS1.1381/pL3CUP1的抗铜能力(6mM Cu2 )显著高于AS1.1381/pLAFR3(4.5mMCu2 ),重组菌株抗铜性得到提高。     

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒. 利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子. 通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.     

酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化

用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段，与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL,将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后，在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD／-Leu)平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。     

产志贺毒素大肠杆菌毒素基因的敲除

根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805～1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。     

转牛LDHA基因酿酒酵母构建及产乳酸能力分析

【目的】探究转牛乳酸脱氢酶A基因（LDHA）酿酒酵母发酵制备食品级乳酸的可行性,为采用转基因商业酿酒酵母规模化制备乳酸提供技术支撑。【方法】从NCBI网站检索牛LDHA基因编码序列,并将编码序列中的同义密码子替换为酿酒酵母偏好密码子,经人工合成后导入酿酒酵母表达载体pAUR123,再将重组表达载体p AUR123-LDHA导入商业化酿酒酵母EC1118株,采用Aureobasidin A筛选转基因酿酒酵母。将转基因及非转基因酿酒酵母EC1118株分别接种于含200 g/L葡萄糖的YPD液体培养基中连续培养5 d,期间检测2组酿酒酵母的LDHA活性及其发酵产乳酸能力,以评估转牛LDHA基因酿酒酵母发酵制备乳酸的可行性。【结果】牛LDHA基因编码序列长1170 bp,共编码389个氨基酸残基;以酿酒酵母偏好密码子替换牛LDHA基因编码序列中的同义密码子,其替换率高达58.35%。牛LDHA在酿酒酵母中的预计半衰期>20 h,其二级结构富含α-螺旋和无规则卷曲。替换后的牛LDHA基因编码序列由表达载体pAUR123携带导入酿酒酵母中,经Aureobasidin A筛选获得1株转基因酿酒...     

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2.质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力.     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建

 【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体，为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段，采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点，设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段，将同源片段克隆后，构建百脉根特异的叶绿体转化载体；构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35 kb psbA 和1.5 kb trnK两段相邻叶绿体 DNA为定点整合外源基因的同源重组片段，包含以叶绿体基因特异强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列的E2基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒。【结论】经PCR和酶切验证，所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

酵母CFD1基因缺失菌株构建及其对复制寿命的影响

目的测定CFD1基因缺失对酿酒酵母复制寿命的影响。方法运用基因同源重组技术构建单基因缺失酵母菌株,利用光学显微镜检测酵母细胞的复制寿命。结果与野生型酵母菌株（29.29±8.71代对比,CFD1基因缺失酵母菌株复制寿命（27.27±8.01）代有所变短,但差异无统计学意义。结论 CFD1基因缺失不影响酿酒酵母的复制寿命。）     

基因打靶技术在小鼠中的研究及在畜牧中的作用

基因打靶是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或激活的技术。通常意义上的基因打靶主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到改变遗传信息的目的。近几年在大型家畜及小鼠上发展起来的基因打靶技术有借助Cre／LoxP系统建立的条件性基因敲除法、诱导性基因敲除法、基因捕获法。随着基因打靶技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因插入突变和RNAi,它们同样可以达到基因敲除的目的。将新发展的RNm与基因打靶的优势结合起来将是今后生物技术发展的趋势。     

绵羊肺炎支原体P109蛋白质分子特征、原核表达及其免疫反应性

为了研究绵羊肺炎支原体P109蛋白质的结构与功能,本试验对p109基因进行生物信息学分析,并对其部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,采用Western-blot方法对其免疫反应性进行分析。结果显示,P109基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp384高度同源。重组蛋白质在大肠杆菌Rosetta(DE3)工程菌中成功获得表达,以包涵体的形式存在;经纯化的重组蛋白质与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P109蛋白质是绵羊肺炎支原体的免疫原之一。     

重组PEDV-S干酪乳杆菌的构建及其表达

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起猪的呕吐、腹泻及脱水。通过将其S1片段逆转录连接到干酪乳杆菌表面表达载体p LA上,使其表达蛋白,为进一步研究其特性及免疫原性奠定基础。采用TRIzol的方法从PEDV中提取RNA为模板,通过RT-PCR技术获得该病毒的S1片段,然后将该基因连接到载体p LA中并表达。重组菌经过培养表达之后,利用Western blot检测融合蛋白大小约为81 k Da;重组蛋白可被兔源的抗Pgs A血清和鼠源的抗PEDV血清所识别。表明重组干酪乳杆菌成功的表达了融合蛋白。     

特利波契巴尔通体基因敲除体系的建立

本研究旨在建立基于同源重组技术的特利波契巴尔通体基因敲除方法。研究通过扩增并融合Ⅳ型分泌系统VirB4基因的上下游同源片段,将同源片段与pJM05质粒进行体外拼接,并将pJM05-ΔVirB4质粒转化进入S17-1大肠杆菌中;通过双亲接合转移将大肠杆菌S17-1中的pJM05-ΔVirB4质粒转移到特利波契巴尔通体中进行同源臂交换,产生单交换菌株;随后利用质粒中sacB基因表达产物分解蔗糖对自身产生毒性作用,在蔗糖平板中筛选出22个双交换菌株,通过菌落PCR及测序验证,共确定出6个VirB4基因框内缺失菌株;并且测序结果表明这6个菌株在VirB4基因框内缺失了2 136 bp。     

大肠杆菌诺氟沙星超敏感多基因敲除株KYAH06构建与功能验证

以E. coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除：大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除；大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除；大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化，最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL^-1的E. coli KYAH06，为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。