IL-8在LPS诱导的草鱼炎症过程中的表达特征

采用原核表达获得草鱼白细胞介素-8(IL-8)重组蛋白,并以腹腔与皮下组织交替注射的方法免疫小鼠,制备抗草鱼IL-8的多克隆抗体。采用免疫印迹(Western blot)和酶联免疫吸附(ELISA)技术检测抗体的特异性与效价,运用流式细胞术分析健康草鱼及细菌脂多糖(LPS)刺激后草鱼各免疫相关组织中IL-8的表达特征。结果显示,草鱼IL-8多克隆抗体效价可达1∶40 000。健康草鱼的胸腺、头肾、肝脏、肠道、鳃、脾脏、体肾等组织均表达IL-8蛋白,其中,头肾和鳃中表达量较高。LPS刺激后,各组织IL-8蛋白表达量均显著升高,其中,肠道、肝脏、肾脏在LPS刺激4 h后IL-8蛋白上调达最高峰,头肾、脾脏、鳃于LPS刺激后12 h时表达量最高,胸腺则在24 h时达最高峰。研究表明,IL-8参与了草鱼炎症应答;IL-8表达量的升高,可作为早期炎症监测指标,应用于养殖鱼类炎症性疾病的预警指标。     

团头鲂IL-12表达及功能的初步研究

白细胞介素-12（IL-12）是一种连接先天性和适应性免疫系统的重要细胞因子,在免疫反应和炎症反应中均发挥着重要作用。本实验以团头鲂为研究对象,克隆了团头鲂IL-12的4个亚基IL-12A、IL-12Ba、IL-12Bb和IL-12Bc的开放阅读框（ORF）序列,长度分别为588、993、939和837 bp。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果表明,团头鲂IL-12各亚基在检测的10个不同的成鱼健康组织中都有表达,但是在不同组织中的表达模式不同;腹腔注射嗜水气单胞菌后,团头鲂IL-12各亚基在免疫相关组织中显著差异表达;脂多糖（LPS）刺激分离的团头鲂头肾淋巴细胞后,4个IL-12亚基均被快速诱导表达。进一步通过大肠杆菌原核表达系统和变性复性方法得到团头鲂IL-12Bb、IL-12Bc重组蛋白并刺激分离的头肾淋巴细胞,显著上调TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达,表明获得的重组蛋白具有生物学活性。最后对获得的蛋白进行抑菌活性检测,结果表明重组IL-12Bb、IL-12Bc单体蛋白对嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用。综上,本研究结果表明,团头鲂IL-12在调节免疫应答的过程中发挥着重要作用。     

黄鳍鲷白细胞介素1β基因2种表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)基因全长cDNA序列(GenBank登录号为AY669059)设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1β基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1β。以克隆载体pMD18T-IL1β为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1β的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1β和pQE30-mIL1β。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1β基因的体外重组表达研究打下了基础。     

斑石鲷irf3基因鉴定及其在虹彩病毒感染下的表达模式分析

干扰素调节因子（irf3）是干扰素调节因子（IRF）家族的一员,是I型干扰素依赖性免疫反应的主要转录调节因子,在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。本研究中,斑石鲷irf3基因（Oplegnathus punctatus interferon regulatory factors 3,Opirf3）来自实验室斑石鲷基因组数据库,经分析鉴定Opirf3的CDS序列全长1362 bp,可编码453个氨基酸,预测其蛋白分子量为50.0 kDa,理论等电点为4.97,有一个IRF结构域和一个IRF-3结构域。荧光定量分析显示,Opirf3在斑石鲷肝脏、鳃、心脏、皮肤、脾脏、肠、脑、肾、胃和头肾组织均有表达;虹彩病毒感染7 d时,免疫组织肝、脾和肾脏中Opirf3的表达水平显著上调。斑石鲷肾细胞系体外刺激实验显示,不同浓度poly I:C刺激后,Opirf3的表达量较对照组均显著升高,poly I:C浓度为100 μg/mL时,肾细胞中Opirf3的相对表达水平升高,为对照组的86.8倍。siRNA干扰后,斑石鲷肾细胞系中Opirf3表达水平显著下调30%,下游基因IFN-α、CD40、CD80和IL-1β显著下调,IL-6显著上调。以上结果可能表明Opirf3基因参与了I型IFN在斑石鲷抗虹彩病毒过程中的先天免疫反应。本研究可为斑石鲷抗病分子育种提供理论依据。     

黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）血清IgM,并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS—PAGE,电泳结果扫描后经Band Scan5．0软件分析显示,单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56％左右;二者联合使用纯度可以达到69％,而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89％的纯度;纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73．6kD和26．5kD。本研究还以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,采用Western Blot和双向琼脂扩散检测抗血清免疫学活性,并用间接ELISA检测其效价达到1：25600,为进一步开展黄鳍棘鲷免疫学方面的研究奠定了基础。     

淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定

为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。     

大鳍鳠 IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3’非编码区域(UTR)为224 bp,5’UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

大鳍鳠IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3'非编码区域(UTR)为224 bp,5'UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

褐牙鲆白细胞介素21基因克隆及表达分析

利用转录组测序数据信息和PCR技术克隆褐牙鲆白细胞介素21(IL-21)基因的编码区序列,并进行生物信息学分析及表达模式分析。试验结果显示,白细胞介素21基因开放阅读框429 bp,编码142个氨基酸,分子量16.0 ku,在N端具有19 bp信号肽序列。分子系统发育树分析表明,褐牙鲆白细胞介素21蛋白与尖吻鲈以及深裂眶锯雀鲷白细胞介素21蛋白亲缘关系最近。实时荧光PCR结果显示,白细胞介素21基因在所检测的褐牙鲆7种健康组织中均有表达,其中肝脏的表达量最高。用提取的迟钝爱德华氏菌脂多糖免疫刺激褐牙鲆后,白细胞介素21基因的表达在头肾和脾组织中产生不同程度上调,表明该基因参与了脂多糖诱导的免疫应答。利用RNA干扰技术沉默髓样分化因子(MyD88)基因后,白细胞介素21基因的表达出现下调,当再用提取的迟钝爱德华氏菌脂多糖免疫刺激后,MyD88和白细胞介素21基因的表达又均开始逐渐回升,暗示白细胞介素21与MyD88通路具有一定关联性。     

尼罗罗非鱼白细胞介素21基因 (OnIL-21)及其受体基因 (OnIL-21R)克隆及表达分析

白细胞介素21（interleukin 21,IL-21）是一种多效性细胞因子,主要通过其专一性受体（IL-21R）行使免疫调节功能。为研究IL-21及其受体IL-21R在鱼类抵御病原菌的免疫应答过程中的作用,本研究利用反转录PCR（RT-PCR）技术成功克隆了尼罗罗非鱼IL-21基因（OnIL-21）及其受体IL-21R基因（OnIL-21R）,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其mRNA水平的表达。结果显示,OnIL-21及其受体OnIL-21R的开放阅读框为420 bp和1 548 bp,分别编码139和515个氨基酸。经氨基酸序列预测分析,OnIL-21为分泌型蛋白,具有一个Ig-like结构域;而OnIL-21R是跨膜蛋白,具有典型的γ-c链,2个基因的蛋白序列都具有多个保守的磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树结果表明,OnIL-21和OnIL-21R均与斑马拟丽鱼IL-21和IL-21R的亲缘关系最近。组织差异性表达分析发现,OnIL-21在皮肤和心脏组织中表达量较高,在肌肉中较低;而OnIL-21R在鳃和脾脏组织中表达量最高,在肌肉中最低。无乳链球菌和嗜水气单胞菌体内感染和体外刺激白细胞后,头肾和脾脏中OnIL-21和OnIL-21R表达量均呈现显著上调,说明OnIL-21和OnIL-21R可能参与尼罗罗非鱼病原菌感染的免疫应答过程。此外,重组蛋白(r)OnIL-21刺激脾脏白细胞后,OnIL-21R和炎症相关因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10）的mRNA表达均发生显著上调,表明OnIL-21可调控其受体基因OnIL-21R的表达及参与调控机体的炎症反应。上述研究结果阐述了尼罗罗非鱼IL-21与其受体IL-21R的分子生物学特征,并初步阐明了二者参与了机体病原菌感染的免疫应答过程,为进一步探究IL-21通过其受体IL-21R调控机体免疫反应的作用机制和信号通路提供了重要参考。     

黄条鰤白介素-1β基因克隆及其免疫应答分析

白介素-1β是一种典型的促炎细胞因子,参与调控免疫细胞增殖、分化和凋亡等过程。本研究从黄条鰤(Seriola aureovittata)中鉴定到2个白介素-1β分子(分别命名为SaIL-1β1和SaIL-1β2)。SaIL-1β1全长cDNA序列为1 292 bp,开放阅读框长度为828 bp,编码275个氨基酸;SaIL-1β2 cDNA序列为1 337 bp,开放阅读框长度为960 bp,编码319个氨基酸。SaIL-1β1和SaIL-1β2编码的蛋白均含有IL-1保守的结构域和12个β折叠,具有结构上的保守性。组织表达分布显示,SaIL-1β1在头肾中表达量最高,脾脏和肝脏次之;而SaIL-1β2在鳃中表达量最高,头肾和脾脏次之。脂多糖(LPS)刺激后,SaIL-1β1和SaIL-1β2在头肾和脾脏中的表达量均显著增加。在头肾中,LPS刺激后6 h,SaIL-1β1急剧上升至对照组的10.03倍(P<0.05),随后逐渐回落,在12、24、48、72 h分别为对照组的7.15、4.09、2.71、3.03倍(P<0.05);在刺激后6 h,SaIL-1β2表达量急剧上升至对照组的11.49 倍(P<0.05),最后逐渐回落,48 h恢复至正常水平,72 h下降至对照组的0.29倍(P<0.05)。脾脏中,LPS刺激后6 h,SaIL-1β1表达量急剧上升至对照组的6.59倍(P<0.05),随后逐渐回落;SaIL-1β2转录水平表达模式与SaIL-1β2相似。综上,本研究在黄条鰤中鉴定了2种白介素-1β分子,并探讨了其在免疫应答中的表达规律,为研究白介素-1β分子在黄条鰤抗菌免疫中的作用提供了基础。     

珠江口万山群岛黄鳍棘鲷食性随年龄的变化特征

黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)是我国东南沿海地区分布的特色经济鱼类和增殖放流鱼类,研究黄鳍棘鲷的食性变化特征有助于了解其的食物来源及其在食物网中的功能地位。通过胃含物形态学和18SrRNA基因高通量测序的方法分析了万山群岛海域不同年龄(1～3龄)黄鳍棘鲷的食性变化特征。形态学鉴定发现黄鳍棘鲷胃含物中有贝类、蟹类和食糜。18S rRNA基因高通量测序共鉴定出黄鳍棘鲷胃含物中有真核生物16门84种,黄鳍棘鲷主要的食物来源为节肢动物门的锈斑蟳(Charybdis feriatus)和腹针胸刺水蚤(Centropages abdominalis),软体动物门的变化短齿蛤(Brachidontesvariabilis),脊索动物门的圆吻海鰶(Nematalosanasus),红藻门的条斑紫菜(Neopyropia yezoensis),其共占总食物来源的66.73%。万山群岛黄鳍棘鲷主要以动物性饵料为食,对植物性饵料的摄食相对较少。对1～3龄黄鳍棘鲷食性的研究发现,随着年龄的增加,黄鳍棘鲷的主要摄食种类逐渐由节肢动物门和软体动物门转向脊索动物门,摄食的生物物种数量逐渐减少。研究...     

斑石鲷TGF-β1基因克隆和表达分析

虹彩病毒是造成斑石鲷(Oplegnathus punctatus)工厂化养殖中大规模死亡的主要病原,其感染力极强,感染后的斑石鲷死亡率高,严重影响了斑石鲷养殖产业发展。转化生长因子TGF-β1是一种重要的免疫调节因子,在病毒免疫应答中发挥重要作用。为研究TGF-β1在斑石鲷被虹彩病毒感染过程中发挥的作用,运用RACE和实时荧光定量qRT-PCR技术对TGF-β1进行了基因克隆,并对其进行在不同组织、不同时间点相对表达量的差异分析。结果显示,斑石鲷TGF-β1基因c DNA序列全长为3157 bp,5’非编码区长712 bp,3’非编码区长1278 bp,开放性阅读框长1167 bp,编码388个氨基酸,基因组包含6个外显子和5个内含子。同源分析发现,TGF-β1和鱼类相似度较高,与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的同源性最高,为76.67%。TGF-β1在斑石鲷健康组织(肝脏、脾脏、肾脏、头肾、心脏、鳃、胃、肠和皮肤)中均有表达,在头肾、肠、肝脏和皮肤组织中表达量较高,而在脾脏和肾脏组织表达量较低。为进一步研究TGF-β1在病毒感染过程中相对表达量的变化,对健康斑石鲷注射虹彩病毒进行刺激,随后比较了TGF-β1在脾脏、肝脏、肾脏、头肾4个不同组织、不同时间点的相对表达量的差异,在头肾、脾脏和肝脏中,病毒刺激后TGF-β1的表达量均出现升高,但在脾脏和肝脏中,峰值出现在刺激后第4天,而在头肾中峰值出现在感染后的第10天。在肾脏中,病毒刺激后的TGF-β1的表达呈现下降趋势,0 d表达量最高,4、7 d依次降低,7 d降至最低,10 d有所恢复。以上研究表明,TGF-β1可能响应了虹彩病毒对机体的刺激,可能在对病毒免疫应答中发挥作用。而病毒感染后不同组织中TGF-β1相对表达量的差异,则值得进一步研究。     

培养温度对LPS诱导的离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响

为研究温度对离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响,从大黄鱼头肾组织中分离巨噬细胞结合贴壁筛选法得到细胞单层后,在不同温度(16、22和28°C)下培养备用。使用25μg/mL的脂多糖(LPS)孵育细胞2 h后,测定不同培养温度下离体细胞活力、呼吸爆发活性、抗氧化酶(SOD和CAT)活性以及相关基因(SOD、CAT、Hsp70和IL-1β)表达的情况。结果显示,体外培养细胞36 h后,16°C和22°C条件下培养的细胞活力显著高于28°C处理组;LPS处理组大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性显著升高,但SOD和CAT酶活性较对照组显著下降。高温(28°C)显著提高了细胞CAT酶的活性和基因表达水平,但SOD酶活性和基因表达变化差异不显著;LPS显著促进了大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达,并且随培养温度升高细胞IL-1β基因的表达水平显著降低;但大黄鱼头肾巨噬细胞Nrf2和Hsp70的基因表达量随温度升高而显著增加,且LPS处理组细胞基因表达水平显著高于对照组。研究表明,温度显著影响了离体大黄鱼头肾巨噬细胞的抗氧化能力和LPS所诱导的促炎基因的表达,Nrf2和Hsp70在这一过程中可能发挥重要作用。     

舟山海域4种鲷科鱼类线粒体Cytb基因全序列克隆分析

摘要：克隆测序了分布于舟山海域的真鲷（Pagrus pagrus）、黑鲷（Sparus macrocephalus）、黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）和二长棘鲷（Parargyrops edita）4种鲷科鱼类的线粒体Cytb基因1141bp的全序列。通过对4种鲷科鱼类Cytb基因序列的比对分析,发现了292个核苷酸变异位点,其中存在186个信息位点,序列中的转换大于颠换,碱基替换多发生于密码子第3位。遗传距离分析表明,4种鲷科鱼类的遗传差异在0．0967～0．2275之间,其中真鲷与二长棘鲷之间遗传距离最小,为0．0967,黄鳍棘鲷与二长棘鲷的遗传距离最大,为0．2275;序列变异的转换／颠换比值在2．2930～7．3587之间。以25种鲈总科鱼类构建的系统树表明鲷科鱼类与其他科的鱼类存在较远的遗传亲缘关系。     

军曹鱼白细胞介素1β基因的克隆、分析及表达

采用同源克隆和锚定PCR技术，从军曹鱼(Rachycentron canadium Linnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin-1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL-1β的cDNA全长1104bp，3′非编码区域(UTR)为255bp，5′UTR为108bp，开放阅读框(ORF)为741bp，编码246个氨基酸，分子量大约为27．68kD，理论等电点为5．71。同源性分析表明，该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL-1β基因具有很高的相似性，并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究，发现IL-1β基因在鱼体的多种组织中都有表达，而经过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，目的基因在组织中的表达明显增加，但是在不同组织内的表达存在差异。研究显示，军曹鱼IL-1β基因存在组成型和诱导型2种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

香菇多糖和黄芪多糖对鲤免疫细胞的活性和IL-1β体外诱生表达的影响

为了探讨香菇和黄芪多糖对鲤免疫细胞的免疫活性作用,采用Percoll密度离心等技术,对鲤的头肾巨噬细胞和外周血白细胞进行分离纯化,并离体培养,从细胞和分子水平上研究了香菇和黄芪多糖的免疫调节作用.巨噬细胞和外周血白细胞分别体外暴露不同浓度的黄芪多糖和香菇多糖后,采用MTT法测定它们对鲤外周血白细胞增殖的影响;NBT还原法和Griess试剂显色法测定对头肾巨噬细胞的呼吸爆发的影响;实时定量PCR法测定头肾巨噬细胞细胞因子IL-1β诱导表达的影响.结果显示,黄芪和香菇多糖作用头肾巨噬细胞24 h后,香菇多糖浓度为1,10,100μg·mL-1时能显著诱导巨噬细胞的氧爆发活性,黄芪多糖则没有显著的诱导作用;黄芪和香菇多糖作用头肾巨噬细胞96 h后,香菇多糖低浓度时对细胞的氮呼吸爆发活性无显著影响,黄芪多糖浓度10μg·mL-1能显著诱导氮呼吸爆发活性,而在浓度为1000μg·mL-1两者均表现为高浓度抑制作用;两者作用外周血白细胞24 h后,香菇多糖浓度为100,1000 μg·mL-1和黄芪多糖浓度为10,100μg·mL-1时都能显著促进鲤外周血淋巴细胞的增殖;两种多糖作用头肾巨噬细胞24 h后能显著增强IL-1β的体外诱导表达.结果表明黄芪多糖和香菇多糖对离体培养鲤免疫细胞有明显活性作用,对鲤非特异性免疫和特异性免疫具有促进作用.     

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证

将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg,尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS).结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50 ug/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50 μg/尾免疫组及100 μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50 μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48 h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%.研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好.     

虹鳟IL-17多克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。     

鲤IL-17B基因序列特征、表达模式、原核重组蛋白的获得及其促炎作用

为了解鲤白细胞介素17B基因(IL-17B)的功能,实验使用同源搜索和基因克隆技术在鲤基因组中挖掘到2个IL-17Bs基因（CcIL-17B1和CcIL-17B2）,均有3个外显子和2个内含子,编码198个氨基酸,内含IL-17家族特有的由4个半胱氨酸形成的2个二硫键,蛋白序列一致性高达91.92%。共线性分析显示,在硬骨鱼类染色体加倍过程中,IL-17B及其附近基因出现了丢失,大部分硬骨鱼类有1个IL-17B、斑马鱼2个IL-17Bs均丢失,而鲤特有的染色体加倍致使存在2个CcIL-17Bs。实时荧光定量PCR (qPCR)结果显示,CcIL-17Bs在鲤受精卵发育早期（0～12 h）和成鱼性腺中高表达。使用大肠杆菌表达系统,获得了可溶的重组蛋白NusA-17B。肛灌不同浓度的NusA-17B,结果显示,高浓度（500μg/kg）组的1和3 d的鲤肠道组织肠绒毛缺损,出现大量的杯状细胞和炎性细胞,定量分析显示,炎症因子基因IL-1β、IFN-γ、IL-6、趋化因子CCL20和NF-κB的表达均显著上调;7 d时肠道组织结构和炎症相关基因的表达均得到恢复,与对照组无显著差异。低浓度（5...