土耳其东毕吸虫原肌球蛋白基因的克隆

根据日本血吸虫原肌球蛋白cDNA序列和曼氏血吸虫的原肌球蛋白cDNA序列M27512的保守区设计引物，采用RT-PCR方法，成功克隆了土耳其东毕吸虫的原肌球蛋白全长cDNA序列。测序结果表明，TM序列全长1125bp，5’非翻译区为1bp～124bp，3’非翻译区为980bp～1125bp，开放阅读框为125bp～979bp，编码284个氨基酸。将该序列与其他血吸虫的序列进行同源性比较，结果与埃及血吸虫的TM同源性为90％，与曼氏血吸虫、日本血吸虫的TM同源性均为88％，该基因已经提交GenBank，序列号为》N560898。     

土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆及其序列分析

目的利用RT-PCR和RACE技术克隆土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因全长序列并进行序列分析.方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因的保守区设计引物,利用RT-PCR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫的肌动蛋白基因的大片段,再结合RACE技术分别得到肌动蛋白的3＇端和5＇端,将三部分序列拼接后获得肌动蛋白基因的全长cDNA序列并进行序列分析.结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA并提交GenBank,登录号为DQ017265,核酸序列比对表明东毕吸虫肌动蛋白基因的核苷酸序列和日本血吸虫、曼氏血吸虫的同源性分别为90%和91%.结论土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础.     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

东毕吸虫抗原特异性的研究──土耳其斯坦东毕吸虫成虫抗原SDS-PAGE分析

为了探明东毕吸虫成虫可溶性抗原的多肽组分,供今后在免疫诊断和防治东毕吸虫的应用,本试验应用ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ首次对绒山羊体内寄生的土耳其斯坦东毕吸虫成虫可溶性抗原的多肽组分进行了分析。结果表明该抗原有１７ 条多肽带,其分子量范围２５～９３ＫＤ．其中主带７ 条,分别为２９、３０、３８、４０、６７、７８、９１ＫＤ。本试验初步阐明了土耳其斯坦东毕吸虫成虫抗原的多肽组分,为进一步对该病免疫诊断用抗原的分离、纯化,提高抗原的敏感性和特异性奠定了基础     

基于线粒体nad4基因探讨土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生位置

为探讨土耳其斯坦东毕吸虫在血吸虫中的系统发生位置,本研究设计一对特异性引物,通过PCR方法对土耳其斯坦东毕吸虫(绵羊源)线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4)进行扩增和测序分析,并与GenBank中相关血吸虫nad4基因进行比对。结果显示,本研究克隆的该吸虫线粒体nad4基因序列大小约为1030bp,与已发表的其它血吸虫线粒体nad4基因的同源性为51.6%～66.7%,其系统发生位置属于非洲血吸虫种群。     

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫节变种扫描电镜观察及与其它血吸虫的比较

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫节变种分别收集于四川和黑龙江省，按常规电镜方法处理后，以日立JSM－800扫描电镜观察并摄片。观察显示中华血吸虫体表无结节，其雄性成虫体表结构近似于日本血吸虫等亚洲血吸虫。与文献描述的采集于泰国的中华吸虫也无明显差异。观察同时表明土耳其斯坦东毕吸虫节变种与程氏东毕吸虫基本无差别，二者的感觉球种类与土耳斯坦东毕吸虫一致，但数目较后者为多。同时结合已发表的有关裂体属血吸虫SEM研究结果，对裂体属血吸虫SEM超微结构特点列表进行了比较，按照Rollinson分的组方法，中华血吸虫属于无结节组，而东毕吸虫属于不带棘的有结节组。     

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫结节变种扫描电镜观察及与其它血吸虫的比较

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫结节变种分别收集于四川和黑龙江省,按常规电镜方法处理后,以日立JSM-800扫描电镜观察并摄片.观察显示中华血吸虫体表无结节,其雄性成虫体表结构近似于日本血吸虫等亚洲血吸虫,与文献描述的采集于泰国的中华血吸虫也无明显差异.观察同时表明土耳其斯坦东毕吸虫结节变种与程氏东毕吸虫基本无差别,二者的感觉球种类与土耳其斯坦东毕吸虫一致,但数目较后者为多.同时结合已发表的有关裂体属血吸虫SEM研究结果,对裂体属血吸虫SEM超微结构特点列表进行了比较.按照Rollinson的分组方法,中华血吸虫属于无结节组,而东毕吸虫属于不带棘的有结节组.     

东毕吸虫抗原特异性的研究：土耳其斯坦东毕吸虫成虫抗原SDS—PA …

为了探明东毕吸虫成虫可溶性抗原的多肽组分,供今后在免疫诊断和防治东毕吸虫的应用,本试验应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ首次对绒山羊体内寄生的土耳其斯坦东毕吸虫成虫可溶性抗原的多肽组进行了分析。结果表明该抗原有１７条多肽带,其分子量范围２５－９３ＫＤ。其中主带７条,分别为２９,３０,３８,４０,６７,７８,９１ＫＤ。     

鹅FSH基因原核表达

促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）作为调节家禽卵泡发育重要的候选基因,但FSH在生物体内的半衰期非常短,本试验将具有延长基因半衰期作用的CTP序列添加到鹅FSH基因各亚基的C末端进行基因融合,以期获得pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α重组蛋白。设计去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经融合PCR扩增获得了目的基因FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α,通过构建原核表达载体pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,蛋白纯化。结果显示,3个融合蛋白FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α的IPTG最佳诱导时间分别为4、5和5h,最佳诱导浓度分别为0.2、0.8和1.5mmol/L,且都是以包涵体形式存在,相对分子质量分别为32 000、35 000和46 000,与预期大小一致。结果表明,本试验成功构建了鹅pET-32a-FSHα-CTP、pET-32a-FSHβ-CTP和pET-32a-FSHβ-CTP-α的原核表达载体,并对它们的重组蛋白进行了纯化,为开展鹅FSH的基因免疫研究和鹅rFSH生物制剂研发奠定基础。     

蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础.     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株ORF3基因的原核表达

通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.     

牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因的原核表达及其免疫活性分析

参考羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的抗原表位基因序列,利用DNAStar软件预测了牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的5个抗原表位区,设计5对在上游和下游含有特异性限制性内切酶的引物,以牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因阳性质粒pMD18-T-lkrA为模板,PCR扩增了预测的5个抗原表位区基因,分别命名为PL1、PL2、PL3、PL4和PL5,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX HTa后转化E.coli BL21(DE3),37℃条件下,用IPTG诱导表达,结果PL1、PL2、PL4和PL5在pGEX-6p-1中获得了表达,而PL3在pPROEX HTa中获得了表达。Westem blot试验结果表明,牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素蛋白5个抗原表位区的重组蛋白PL1、PL2、PL3、PL4和PL5均与坏死梭杆菌多克隆血清反应。     

猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。