山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定

摘要：比较四种原代角膜内皮细胞分离培养方法,并对分离培养的山羊角膜内皮细胞生长特性进行初步研究。取屠宰1～2月龄关中奶山羊角膜,无菌分离角膜内皮层和Descemet’s membrane,分别用组织块法、胰蛋白酶法、dispase法和dispase加胰蛋白酶法分离培养原代角膜内皮细胞,比较这四种方法处理后细胞离散和贴壁情况。结果显示,dispase加胰蛋白酶法为最佳分离纯化角膜内皮细胞的方法。分离的细胞经形态学观察、免疫组化染色、Giemsa染色、扫描电镜和透射电镜等方法鉴定为角膜内皮细胞。说明dispase加胰蛋白酶法为角膜内皮细胞分离培养的理想方法,该方法可为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究和构建组织工程化人工角膜内皮提供种子细胞。     

山羊骨髓MSCs体外向成骨细胞诱导和分化

以关中奶山羊骨髓间充质干细胞（MSCs）为对象，研究了体外诱导山羊MSCs向成骨细胞的分化。结果表明，山羊MSCs在地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸的作用下，从诱导的第4~5天开始，即可见有些MSCs体积逐渐增大，由梭形或多角形转变为立方形或卵圆形；随着诱导时间延长，立方形或卵圆形细胞不断增多，到第15天时，有较多的立方形细胞，且这种变化经历了从立方形向卵圆形转变的过程；第25天，可见卵圆形和方形细胞堆积，诱导分化率为90.2% ± 2.97%。说明其被诱导分化为成骨细胞表型，该类细胞呈茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色阳性。从而证明了山羊骨髓MSCs具有体外分化为成骨细胞的潜能，从而为利用该类细胞作为实验模型研究骨骼缺损修复等提供了科学依据。     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

胎猪胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及其移植治疗裸鼠糖尿病的研究

缺乏供体细胞制约着胰岛替代疗法在Ⅰ型糖尿病治疗过程中的应用。本研究对实验室分离保存的胎猪胰腺干细胞(fetal porcine pancreatic stem cells,FPPSCs),体外诱导分化为胰岛素分泌细胞以及移植治疗裸鼠糖尿病的能力进行了深入研究,以探讨该细胞株作为异种供体细胞的潜力。研究结果表明,该细胞体外增殖活力旺盛,其形态及表面抗原表达特征与间充质干细胞极其相似,除表达胰腺干细胞相关标志外,FPPSCs还表达一些胚胎干细胞的相关标志。采用无血清诱导方案诱导2周后,FPPSCs形成DTZ染色阳性的胰岛样细胞团(islet-like cell cluster,ICC),该细胞团表达胰岛素、Glut-2等胰岛素分泌细胞功能相关的蛋白。RT-PCR结果显示,诱导后,胰腺干细胞相关标志表达减弱,而成熟胰岛素分泌细胞相关标志表达增强。葡萄糖刺激实验结果显示,诱导后,FPPSCs合成、分泌胰岛素和C-肽的能力显著增强(P<0.05)。将诱导2周后的细胞移植到糖尿病裸鼠腹腔内,可缓解其高血糖状况。结果提示,FPPSCs具有间充质干细胞的特性,体外能够诱导分化为胰岛素分泌细胞,并具有改善糖尿病裸鼠高血糖症状的...     

山羊皮肤组织细胞分离与培养的研究

本实验研究了山羊皮肤组织细胞的分离,培养,纯化方法和生长特征,获得了传统代培养的山羊皮肤上皮细胞与成纤维细胞,组织块贴附培养和分散单细胞接种培养均能获得原代山羊皮肤细胞。用１５０ＩＵ／ｍＬ胶原酶ＩＴＣＭ１９９液３７℃下培养消化１０ｈ,可较好地分解组织块,产生接种浓度的分散单细胞。     

山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养

采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。     

人胎儿骨髓间充质干细胞分离培养与生物学特性研究

摘要 目的 人胎儿骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的群体倍增次数（70～80次）是成体BMMSCs (30～40次）的两倍,分化能力优于成体干细胞,尤其是前3月龄胎儿BMMSCs,最接近胚胎干细胞,端粒酶活性高,生长速度快,分化能力强,可能是组织工程和再生医学研究理想的种子细胞。本研究的目的是建立２～３月龄流产人胎儿BMMSCs体外分离方法, 筛选其体外培养体系,鉴定其生物学特性及安全性,为体外诱导分化和组织工程研究提供种子细胞。方法 实验于2005-04/12在国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心完成。采取纵向剪开骨髓腔涮洗细胞和全骨髓培养法分离２～３月龄流产胎儿BMMSCs, MTT法筛选基础培养液和血清浓度并制作生长曲线,流式细胞仪和免疫组织化学法鉴定细胞抗原标志,并通过核型分析和成瘤实验评估细胞的安全性。结果 沿长轴剪开骨髓腔涮洗细胞法是获得２～３月龄人流产胎儿四肢长骨骨髓的实用方法。在本实验范围内α-MEM+20%FBS是体外培养2～3月龄流产胎儿BMMSCs的最佳体系。分离的第３代BMMSCs除表达成体BMMSCs表面抗原标志外还表达Oct4、SSEA3和SSEA4,第6、12和24代细胞在对数增长期的群体倍增时间分别为34h、36h和40h,且均为二倍体核型、不成瘤。结论 2～3月龄人流产胎儿BMMSCs在体外容易分离和培养,表达部分胚胎干细胞抗原标志,生长速度快,传代次数多,安全性良好,可以成为人类组织工程和再生医学研究理想的种子细胞。     

转EGFP基因猪羊水干细胞的体外分化

目的：获得转EGFP基因猪羊水干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能。方法：利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿羊水中分离培养羊水干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果：成功分离培养出羊水干细胞,获得转EGFP基因羊水干细胞,羊水干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。羊水干细胞中β-Actin、NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的羊水干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞（表达LPL和PPARγ-D）、成骨细胞（表达Osteonectin和Osteocalcin）、肌细胞（表达myf-6和myoD）和内皮细胞（表达CD31、CD34、CD144 和eNOS）。结论：从猪胎儿羊水分离羊水干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因羊水干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对羊水干细胞进行标记、追踪。