应用生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法检测谷物中的玉米赤霉烯酮

基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法(ELISA),建立了玉米赤霉烯酮(ZEN)的ZEN-ELISA检测方法。该方法的检测灵敏度为0.8 ng/ml,批内、批间变异系数分别为5.1%和8.6%,平均加样回收率为91.2%;抗ZEN单克隆抗体与玉米赤霉醇的交叉反应度为12.3%,而其与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应;相关试剂在4℃存180 d后各检测参数基本无变化;该方法与商品ELISA试剂盒对同一样品ZEN测定结果的相关系数为0.943 2。说明该方法的特异性和稳定性较好,测定结果准确,可用于ZEN的大量筛查。     

玉米赤霉烯酮液相芯片定量检测方法的研究

建立玉米赤霉烯酮(ZEN)液相芯片定量检测方法。采用间接竞争法原理和液相芯片技术平台,选用ZEN多克隆抗体对ZEN定量检测方法进行探索。首先将ZEN-BSA与36﹟微球偶联,同时加入待检的游离的ZEN小分子和其标记有生物素的ZEN多克隆抗体,偶联抗原和目标抗原竞争结合生物素标记抗体,通过报告分子SA-PE在532nm波长的激光下,即可检测出报告分子发出的荧光强度,荧光强度与待检ZEN的量成反比。通过优化液相反应体系中ZEN多克隆抗体浓度以及抗原抗体孵育时间,建立了ZEN液相芯片定量检测方法。结果表明:本研究建立的ZEN液相芯片定量检测方法,采用的偶联抗原为ZEN-BSA,偶联量为100μg。ZEN多抗临界饱和浓度为10μg.mL-1,偶联抗原和抗体最佳孵育时间为15h。建立的标准曲线线性方程为y=0.0004x+0.0013(R2=0.9988),以国际通用的IC50作为衡量标准,其最低检出浓度为3.25ng.mL-1,线性范围为0.05~10ng.mL-1。建立的ZEN液相芯片检测方法,快速、灵敏、简便、适用于大量样本的检测。     

高效液相色谱-串联质谱法测定粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮

建立了粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。样品用三氯甲烷提取,经氢氧化钠溶液和二氯甲烷反萃取净化,定量浓缩后采用HPLC-MS/MS测定。两种目标化合物的线性范围为0.2~100 ng/mL,相关系数(r)大于0.99,α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的检出限分别为1.5μg/kg和1.0μg/kg,不同样品基质加标回收率范围为70.6%~98.9%,相对标准偏差(RSD,n=6)不大于10%。该方法具有灵敏度高、重现性好和成本相对较低等特点,适用于粮油食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定。     

东北地区水稻、小麦和玉米镰孢菌鉴定与ZEN毒素检测

在黑龙江、吉林和辽宁三省的13个市县,水稻、小麦和玉米的主要产区共分离到214株镰孢菌株,其中分离频率最高的是禾谷镰孢菌(58.1%)。镰孢菌株产生玉米赤霉烯酮(ZEN),具有较强生物毒性,对人畜有很强的毒害作用,因此检测作物中玉米赤霉烯酮含量是十分必要的。单克隆抗体进行特异性分析结果显示,抗-ZEN单克隆抗体与ZEN、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉烯醇结合率分别为100%、188.7%、43.9%和25.6%,而与脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉毒素的结合率则均小于1.0%,由此证明试验制备的单克隆抗体具有较高特异性。以该单抗为依据建立的ELISA检测法,检测限为0.4 ng/m L,检测区间为0.4~25.00 ng/m L,曲线回归方程y=-0.7673x+3.1318,与相似毒素的交叉反应率均小于1.0%,回收率在79%~112%之间。用ELISA产毒能范围在0.27~1.61μg/L,其中有6株禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)菌株具有产毒能力。研究结果说明建立的间接竞争ELISA方法可以用于检测玉米赤霉烯酮。     

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度 玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇（zearalanol,ZAL）单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮（zearalanone, ZAN）制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺（EDC）法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50 μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC₅₀)为577 pg?mL ^-1,亲和力常数Ka=6.21×10 ⁷L?mol ^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇（β-zearalanol, β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZEL）、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

动物饲料中玉米赤霉烯酮ELISA检测方法的建立

为检测动物饲料中玉米赤霉烯酮的含量,建立酯联免疫检测法(ELISA).结果显示:该方法检测回收率范围为67%～99%,其最低检出限为0.1 μg/kg;以建立的ELISA法对随机添加的35个普通动物饲料样本进行分析,并以HPLC法对同一批样品进行检测,两种方法回收率相关系数为0.956 1.证明建立的ELISA检测方法适合动物饲料中玉米赤霉烯酮的检测.     

玉米赤霉烯酮及其衍生物分析方法的研究进展

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素.ZEN对肝脏系统、免疫系统均有很大的危害,并且有引发肿瘤的可能性.鉴于ZEN及其衍生物在食品、农产品以及动物饲料中普遍存在并且危害较大,对ZEN及其衍生物的提取、净化及检测方法的研究作一综述,以期为同类研究提供参考.     

高效液相色谱-二极管阵列法对中药中玉米赤霉烯酮毒素的检测效果

为建立简便易行、快速准确检测中药中玉米赤霉烯酮毒素的方法,对107个中药样品中的玉米赤霉烯酮毒素采用高效液相色谱-二极管阵列检测法进行测定。结果表明:玉米赤霉烯酮毒素在5～1 000ng/mL范围内线性关系良好,检测限(LOD)为25.7μg/kg,回收率82.4%～92.8%,RSD2.4%～8.8%。高效液相色谱-二极管阵列检测法简便快速、通用性强、结果准确可靠,可满足不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素检测的需要。     

竞争间接ELISA检测饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮

应用本实验室研制的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体建立的竞争间接ELISA方法对江西省部分猪场的45份猪全价饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的含量进行了检测,结果67%样品的玉米赤霉烯酮含量大于100 ng/g,4份样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量超过国家限量标准100 ng/g。     

农产品中玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇(ZER)残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原,ZER为竞争半抗原,两者与一定量的抗玉米赤霉醇单克隆抗体反应,应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测,同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法,其最适包被浓度为1∶5 000,抗体最适工作浓度为1∶2 500,酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml,添加回收率在70.0%~116.0%,变异系数小于20%,在2~8℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测,应用前景广阔。     

玉米赤霉烯酮生物合成条件的研究

从自然界中分离得到的玉米赤霉菌 G.zeae BAU_(-z8)菌系只具有在固体培养基中合成玉米赤霉烯酮的能力。经过亚硝基胍和紫外线对 BAU_(-z8)的诱变处理后,再经筛选和分离纯化,得到了具有在液体常温条件下生成玉米赤霉烯酮的突变株D_(4-21),并对其生成玉米赤霉烯酮的条件进行了研究。试验表明:培养基的碳源、氮源种类;碳、氮、磷的浓度及 C/N 值;初始 pH 值、培养温度、通气量等因素都对玉米赤霉烯酮产量有很大影响。通过试验,确定了摇瓶发酵培养基成份的最佳组合以及最适的培养条件为:葡萄糖18%、尿素0.27%、K_2HPO_4 0.05%、酵母膏0.10%、MgSO_4 0.25%、KCl 0.025%、pH5.4—5.5(自然)、装量:120ml/500ml 摇瓶、温度:21—24℃,经摇床震荡培养2周,产量可达2—2.2g/l。     

猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定

为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定基础。     

抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达

根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经（Gly4Ser）2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶（AP）编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉烯酮毒素的ELISA检测奠定了基础。     

同时检测AFB_1和ZEA免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将其与抗AFB1和ZEA单克隆抗体进行偶联,并把偶联物、AFB1-STI、ZEA-OVA以及硝酸纤维素膜(NC膜)等组装成免疫层析试纸条,同时进行检测条件的最优化设计。胶体金偶联AFB1和ZEA抗体最适pH同为7.0,最适抗体浓度分别为5.0和2.5μg.mL-1,NC膜上包被AFB1-STI和ZEA-OVA的浓度分别1.0和2.0mg.mL-1,为该方法可同时定性检测样品中AFB1和ZEA,其最低检测限分别达到5μg.kg-1和50μg.kg-1;与黄曲霉毒素M1、脱氧血腐镰刀菌烯醇的交叉反应率小于1%。该试纸条具有可同时检测两种真菌毒素的特点,适用于同一样品中多种毒素的快速检测。     

番鸭小鹅瘟病毒的分离与鉴定

从临床表现腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征的发病雏番鸭肝、脾中分离到2株病毒（命名为GPV-PT株和GPV-F株）,分离株在间接免疫荧光抗体试验（IFA）和琼脂扩散沉淀（AGP）试验中只与GPV单抗反应,与MPV、NDV、IBDV单抗和DHV阳性血清均不发生反应;电镜观察见到实心和空心两种粒子,无囊膜,圆形,呈立体对称,直径20～24 nm;分离株无血凝活性;对紫外线和胰蛋白酶均不敏感;对番鸭胚的ELD50为lg6.5;雏番鸭人工感染病毒后出现与自然病例相似的症状,并回收到病毒。上述结果表明分离的2株病毒均为番鸭小鹅瘟病毒。     

Effects of Monoclonal Antibody Against Porcine 40-kDa Adipocyte-Specific Membrane Protein on Endocrine Secretion in Pigs

The present study was to investigate the effect of monoclonal antibody against porcine 40-kDa adipocyte-specific membrane protein on endocrine secretion in pigs, in order to provide the evidence for application of this antibody to reduce excessive fat deposition in pig production. 40 Landrace×Saba pigs were randomly divided into 8 groups： 2 control groups were given saline with 10 mL, respectively, and the 6 treatment groups were given monoclonal antibody against porcine 40-kDa adipocyte-specific membrane protein with 0.1, 0.5, and 1.0 mg ·kg^-1 body weight at 15 or 60 kg body weight, respectively, all treatments were performed by intraperitoneal injection. The results showed that this monoclonal antibody could significantly reduce serum insulin level and increase levels of serum growth hormone （GH）, insulin-like growth factor-1（IGF-1）, triiodothyronine （T3）, and tetraiodothyronine （T4） either at 15 or 60 kg body weight injection. However, more marked effect was observed at 15 kg body weight treatment. Moreover, the dose-dependent effect of this monoclonal antibody on endocrine secretion was also observed. This result revealed that this monoclonal antibody increased secretion of hormones regulating fat lysis and reduced secretion of hormones regulating fat synthesis, suggests the reduction of porcine excessive fat deposition by this monoclonal antibody was carried out through affecting hormones regulating fat metabolism.     

仿刺参体腔细胞CD35的化学发光免疫检测

应用化学发光免疫检测（Chemiluminesent Immunoassay,CLIA）技术检测仿刺参Apostichopus japoni-cus体腔细胞CD35。单克隆CD35一抗抗体,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗,选择对碘苯酚作为发光增强剂,鲁米诺和过氧化氢作为辣根过氧化物酶的底物;对照组用无菌海水代替一抗和二抗,进行化学发光免疫检测。结果显示：试验组发光值（1 321 596.00）和对照组（16 773.20）的发光值差异极显著（P〈0.01）;仿刺参体腔细胞膜上能够检测到CD35的存在,表明仿刺参体腔细胞膜上具有补体受体。     

猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备

P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,且与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠,用大肠杆菌表达的P46蛋白作为筛选抗原制备了2株特异性单克隆抗体1A4和3C11。结果显示,2株单抗ELISA效价最高可达1∶64 000。Western-blot结果表明,2株单抗均能与原核表达的P46蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46 000大小的蛋白发生特异性反应;2株杂交瘤细胞株经3个月冻存或连续传代3个月均能保持较高的滴度。本研究成功制备了2株针对猪肺炎支原体P46蛋白的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。