禽流感病毒几种RT-PCR诊断技术

目前常采用琼脂扩散或间接 EL ISA监测禽流感的抗体水平 ,而针对抗原的检测一般采用病毒分离鉴定 ,这种方法需要的时间较长 ,不能对高致病禽流感做出迅速判定 ,因此 ,生产实践中迫切需要新的快速诊断方法。 RT-PCR就是一个很有开发、推广前景的快速诊断技术 ,特别是随着整个行业技术水平的提高 ,RT-PCR逐渐成为一种常规方法 ,可以应用于病原核酸的检测和亚型的鉴别 ,在禽流感病毒的快速诊断中越来越受到重视。依据其原理和技术特点的差异 ,RT-PCR技术又分为常规、巢式、荧光、多元 PCR和 PCR-RFL P、RRT-PCR等。本文对这些 RT-PCR技术在禽流感诊断中的应用做了简要论述。     

禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能

高致病性禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种急性传染病。AIV呈球形,有囊膜。其表面主要有2种糖蛋白,即血凝素和神经氨酸酶。其中神经氨酸酶具有重要功能,其对病毒的释放及病毒在感染细胞周围的扩散能力有很大影响。此外,神经氨酸酶对其周围的血凝素切割能力也有很大影响,从而在一定程度上可以导致病毒致病性的不同。神经氨酸酶是AIV中另一种重要抗原,抗神经氨酸酶的抗体可为机体遭受流感病毒攻击提供一定的保护力。因此,神经氨酸酶对AIV的生物学特性具有重要意义。     

New perspectives in avian influenza diagnosis

Recent outbreaks of avian influenza (AI) occurring in Europe, in the Americas, in Asia and in Africa have provided field evidence of how challenging the control of this infection can be, particularly in densely populated poultry areas or in areas where free-range rural village poultry and backyard flocks are present. In these areas, laboratory testing is mainly applied to trace viral circulation in a given area or in a susceptible population to implement an early warning system, rather than to diagnose the presence of the virus in a diseased flock or animal. This implies the use of rapid, sensitive and possibly cost-effective laboratory tests adaptable to very high throughputs. As a consequence, new diagnostic approaches and technologies have been increasingly developed and applied. Molecular biology and biotechnology are providing important and precious contributions to the field of AI diagnosis, making extremely rapid, specific and sensitive techniques available. However, the use of some of these technologies is still limited, due to their costs and to the requirement of advanced technical and scientific expertise. Therefore, more conventional and well-established techniques, should not be abandoned but rather reconsidered and improved or modified.     

禽流感诊断技术研究进展

禽流感是严重危害畜牧业和人类健康的一种传染性疾病,多年来在世界上许多国家和地区都发生过此病,危害巨大.世界各国对其进行了大量研究.文章就目前国内外对禽流感病毒血清学和分子生物学诊断技术的研究进展做一综述.     

H5N1亚型禽流感病毒起源及演化关系的探讨H5N1亚型禽流感病毒起源及演化关系的探讨

通过综述感染人类的H5N1亚型高致病性禽流感病毒起源及演化关系，表明感染人的A／Hongkong／97（H5N1）株及目前流行的高致病性禽流感病毒可能起源于禽源的A型流感病毒株（A／Goose／Guangdong／1／96）。自1996年以来，H5N1亚型禽流感病毒的基因型经Gs／Gd，A，B，C，D，E，V，W，）X0—X3，Y，Z和Z^＋不断的演化为目前流行的基因型Z。高致病性禽流感病毒（H5，H7和H9亚型）在禽，特别是水禽体内的重组或重配而相互传播，并随候鸟的迁徙而传播不易消灭，H5N1亚型的禽流感在不同地区的不断暴发与流行已严重威胁着养禽业的发展及人类的健康，需要进行长期监控。     

禽流感病毒检测方法研究进展

禽流感病毒由于亚型众多,且各亚型之间无交叉反应性,这使得禽流感病毒的检测工作较为困难.目前,传统的禽流感病毒检测方法主要是病毒分离和血清学方法.而分子生物学检测方法因其具有更加灵敏、特异、快速等特点,成为了当前禽流感病毒检测方法的主要发展方向.同时,人们也正致力于将一些新兴的检测方法应用到禽流感病毒的检测中来.论文就近年来禽流感分子生物检测方法和这些新兴检测方法的研究进展做一综述.     

禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展

禽流感病毒基因组由8条单性负链RNA组成,血凝素基因是禽流感病毒基因组中变异最大的基因,禽流感病毒的抗原性和致病性很大程度上取决于该基因的变异情况。血凝素在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用,但可刺激机体产生中和抗体来中和病毒的感染力,而且血凝素诱导机体产生的体液免疫反应,对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用,使目前研制血凝素基因工程疫苗成为禽流感病毒疫苗的研究热点。血凝素发挥功能之前必须裂解为两条肽链HA1和HA2,其裂解位点的氨基酸残基的组成是决定禽流感病毒致病力高低的主要因素。文章主要从血凝素的基因及其编码的蛋白、裂解位点序列和基因疫苗等角度对禽流感病毒血凝素分子生物学的研究状况进行了综述,可为禽流感的预防和治疗提供参考。     

禽流感病毒HA1蛋白的原核表达及其免疫原性的初步研究

从H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR克隆全长血凝素(Hemagglutinin,HA)基因,并进一步克隆HA的主要抗原区HA1基因.将HA1克隆到原核表达载体pGEXKG,与谷胱苷肽(GST)融合表达,表达的融合蛋白GST-HA1以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性处理,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的免疫学活性.ELISA检测发现,GST-HA1只能与H9亚型禽流感病毒抗体发生反应,而与H5和H7亚型禽流感病毒抗体无交叉反应.进一步将纯化的融合蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠,免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体.制备的HA1蛋白特异性强,具有良好的免疫原性,为禽流感病毒的鉴别诊断和禽流感疫苗开发奠定了基础.     

AIV致病分子基础的研究进展

在自然条件下 ,AIV感染的宿主范围有较强的特异性 ,各毒株所表现的毒力也有所不同。从 HA蛋白切割位点氨基酸序列、HA蛋白切割位点附近的糖基化位点数目、HA蛋白受体结合位点性质以及 NA茎区长度等方面 ,阐明了 AIV毒力的差异及其感染宿主特异性的分子机理 ,为更好地预防与控制 AIV奠定理论基础。下面对 AIV致病的分子基础研究进展作一综述     

禽流感病毒感染的宿主免疫应答

禽流感病毒(AIV)亚型众多、宿主广泛、抗原易变,不同种类的宿主对AIV的反应差异很大。体液免疫可提供抗疫病的保护,抗血凝素的中和抗体是主要的决定因素。细胞毒性T细胞(CTL)反应主要是针对比较保守的内部蛋白,细胞免疫在不同亚型或不同毒株间有交叉反应性,但保护性低。AIV感染的早期,CTL和细胞因子等细胞免疫对限制病毒扩散等起一定作用;感染后期,中和抗体的产生对病毒的清除和宿主恢复起重要作用。     

H5N1亚型禽流感病毒起源及演化关系的探讨

通过综述感染人类的H5N1亚型高致病性禽流感病毒起源及演化关系,表明感染人的A/Hongkong/97(H5N1)株及目前流行的高致病性禽流感病毒可能起源于禽源的A型流感病毒株(A/Goose/Guangdong/1/96)。自1996年以来,H5N1亚型禽流感病毒的基因型经Gs/Gd,A,B,C,D,E,V,W,X0-X3,Y,Z和Z 不断的演化为目前流行的基因型Z。高致病性禽流感病毒(H5,H7和H9亚型)在禽,特别是水禽体内的重组或重配而相互传播,并随候鸟的迁徙而传播不易消灭,H5N1亚型的禽流感在不同地区的不断暴发与流行已严重威胁着养禽业的发展及人类的健康,需要进行长期监控。     

禽流感病毒M2蛋白的原核表达及免疫原性研究

基质蛋白M2是流感病毒的3种表面抗原之一,也是流感病毒中最为保守的蛋白之一,被认为是具有交叉保护能力的流感疫苗的理想候选抗原。论文从H9N2亚型禽流感病毒感染的狗肾传代(madindarby canine kidney,MDCK)细胞中克隆全长M2基因,并采用OE-PCR(overlap extension,PCR)得到缺失跨膜区的M2基因(sM2)。将sM2基因克隆到pGEX-KG原核表达载体,在大肠埃希菌中获得表达量较高的融合蛋白GST-sM2,而且以可溶形式存在。利用亲和层析的方法纯化蛋白,经Western blot证明,GST-sM2蛋白具有良好的免疫原性。ELISA检测发现GST-sM2能与H9、H5和H7亚型禽流感病毒抗体均发生反应。进一步将纯化蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c鼠,结果在免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,为开发具有交叉保护力的禽流感疫苗奠定了基础。     

利用不同源红细胞检测鹅禽流感抗体效价的报告

从某一已免疫禽流感的种鹅场采取30份血样，分别以健康鸡红细胞悬液和健康皖西白鹅红细胞悬液为指示剂，对30份血样进行禽流感血凝和血凝抑制试验。结果：用鸡红细胞悬液作指示剂进行血凝试验，测出抗原4HAU为1：32；用鹅红细胞悬液作指示剂进行血凝试验，测出抗原4HAU为1：8以1：32倍数稀释抗原，分别用鸡红细胞和鹅红细胞悬液作指示剂进行血凝抑制试验，测出30份鹅血清禽流感H5免疫抗体效价的平均值分别为2^5.8和2^3.9；以1：8倍数稀释抗原，用鹅红细胞悬液作指示剂进行血凝抑制试验，测出30份鹅血清禽流感免疫抗体的平均效价为2^5.1。     

禽流感病毒非结构蛋白NS1的分子生物学特性与功能

禽流感严重威胁着世界养禽业及人类健康.随着对流感病毒研究的逐渐深入,人们已经从对流感病毒结构蛋白的研究转移到对非结构蛋白即NS1蛋白的研究上来.研究发现流感病毒的NS1蛋白与流感病毒所诱导的细胞凋亡之间存在一定的联系,其对凋亡的调节作用与流感病毒感染的细胞是否产生干扰素及其所感染的细胞系直接相关.NS1蛋白能够抑制病毒感染细胞干扰素的产生,在流感病毒颉颃干扰素的抗病毒效应中发挥了重要的作用.随着疫苗的广泛使用,无法区分野毒感染和疫苗免疫的禽群,干扰了禽流感的诊断,掩盖了禽流感的流行,增加了禽流感的预防难度.NS1蛋白作为流感病毒的非结构蛋白,具有高度的保守性,在临床应用中作为鉴别诊断免疫禽和自然感染禽的检测抗原具有广阔前景.     

禽流感(H9亚型)油乳剂灭活疫苗的血凝抑制(HI)抗体动态变化的研究

从市场上随机购得不同厂家各两批次的商品化禽流感(H9)油乳剂灭活疫苗，按瓶签说明免疫禽流感母源抗体为阴性的蛋鸡。当疫苗抗体下降至5log2左右时部分鸡再二免，并做田间试验。结果表明，免疫1周出现血清抗体，并逐日上升，3周达高峰。首次免疫8周后抗体下降至5log2左右，二次免疫15周后抗体下降至5log2左右。这四批疫苗的免疫原性较高，安全可靠，两次免疫保护期可保护至开产后。     

禽流感免疫预防的探讨

近年来,在禽流感新型疫苗研究上取得了一定进展,但是目前国内外禽流感免疫仍主要使用灭活疫苗.大量的研究和防控实践表明,有效的禽流感疫苗接种可预防家禽发病,阻断病毒的传播,即使免疫禽受到强毒攻击感染后病毒排出量也显著减少,这就减少了病毒发生自然突变的机会,降低了疫病向禽群和人传播的风险;疫苗的正确应用可在控制禽流感中发挥重要作用.因此,应根据不同地区总体防控策略和具体疫情状况,正确评估禽流感免疫预防作用.在禽流感发生的高风险地区,全面预防接种是防控禽流感的关键技术措施,具有至关重要的作用.     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)NP蛋白的单克隆抗体,将构建的重组表达质粒pET-30a-NP转化BL21细胞,经IPTG诱导表达、纯化后作为免疫原,免疫8周龄Balb/c雌性小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过ELISA方法、Western-blot方法进行筛选,获得3株杂交瘤细胞株,命名为3A6、2H12、5F7,并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传10代均稳定分泌单克隆抗体,分泌的单克隆抗体亚型均为IgG2b,轻链类型均为Kappa。制备并纯化了以上3株单克隆抗体,浓度分别为2.9、2.5、2.8 mg/mL,纯度不低于90%。West-blot检测,单抗与H7血凝抑制试验抗原、H5血凝抑制试验抗原、H9N2病毒能发生特异性反应,说明单抗具有广谱性,且与IBDV、REV、IBV、MDV、ALV、AE、ILT、NDV、EDSV等均无特异性条带出现,说明特异性良好。本研究制备的3株针对禽流感NP蛋白的单抗,具有较好的特异性、保守性和广谱性,为下一步开展AIV诊断试剂如IFA检测试剂盒、ELISA检测试...     

禽流感疫苗研究进展

禽流感是一种重要的人兽共患病,给我国家禽养殖业和人民健康造成了严重威胁,采用疫苗预防是我国控制禽流感的主要措施之一。灭活苗是最为常见的疫苗。现在基于新技术的不断发展,涌现出许多新型疫苗,包括重组活病毒载体疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗等。论文就这些疫苗的构建方法和优点进行介绍,旨在为我国禽流感疫苗研制提供参考。     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

AIV H5N1亚型高免卵黄抗体的制备及理化特性研究

应用禽流感灭活疫苗(H5N1,Re-1株)免疫20周龄的高产来航蛋鸡,制备抗AIV H5N1高免卵黄抗体(IgY).在比较了3种缓冲液对IgY活性的影响后,确定采用水稀释法提取IgY.同时在模拟的胃肠内环境下对IgY的各种理化性质进行了试验.结果表明,纯化的IgY在pH 2.0和胃蛋白酶终浓度为1.5 mg/mL的环境下,以及在pH 8.0和胰蛋白酶终浓度为2.5 mg/mL的环境下,37℃作用1 h后其ELISA抗体效价均无明显下降;同时,热稳定性试验表明,IgY在60℃以下作用30 min,其ELISA抗体效价也无明显下降;中和试验测得IgY的中和效价为1:640,具有较好的中和H5N1亚型AIV的能力.以上结果表明,本试验所制备的抗禽流感H5N1亚型高免IgY具有较高的抗体效价和中和效价,同时还具有一定的耐蛋白酶消化的作用,可用于H5N1亚型禽流感的预防和治疗.