水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达分析及功能研究

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因OsARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型（中花11）植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代OsARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5% PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明OsARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明OsARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的OsARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达OsARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达OsARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】OsARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达OsARD1提高了水稻抗旱性能。     

一个水稻茎叶优势表达锌指基因启动子的克隆及功能分析

通过RT-PCR分析,鉴定了一个在水稻茎、叶中特异表达的锌指基因OsZF153.利用PCR扩增了OsZF153基因上游约2 kb启动子区,构建了启动子与GUS的融合表达载体pCZF153P-GUS.pCZF153P-GUS转基因T0植株GUS活性分析显示:转基因植株的根、茎、叶、颖壳中检测到GUS活性,其中茎和叶GUS表达活性较强,而根和颖壳表达较弱,在雄蕊和雌蕊及种子不同发育阶段中没有检测到GUS活性,表明OsZF153启动子是一个水稻非生殖器官表达,且在茎、叶中优势表达的启动子.     

水稻基因OsGLP1-2的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆水稻镉(Cadmium, Cd)响应基因OsGLP1-2,并对其进行生物信息学及Cd胁迫处理的表达模式分析,为探索OsGLP1-2基因在水稻中应对重金属胁迫的分子机制提供基础。【方法】以水稻为材料,利用PCR克隆OsGLP1-2基因,并利用生物信息学方法对其顺式作用元件、二级结构和疏水性等进行分析,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在100μmol/L Cd处理下,水稻茎部和根部中的表达特征,再利用转基因酵母进行Cd耐受性分析。【结果】水稻OsGLP1-2基因编码区(CDS)序列长度为651 bp,编码216个氨基酸,其编码蛋白的相对分子量为22.48 kDa,理论等电点(PI)为7.16,为稳定性的中性疏水性蛋白,含有Cupin结构域,属于Cupin家族,该家族在植物防御等方面发挥着重要作用。同源家族进化树表明该基因是单独的一支,但与大麦HvGER5a的亲缘关系最为接近,表明OsGLP1-2可能具有HvGER5a类似的功能。二级结构分析表明该蛋白含有10个β折叠、8个α螺旋和17个无规卷曲结构。并且OsGLP1-2具有光、干旱等环境诱导相关的调节元件以及生长素、...     

中国水仙FT基因的表达及功能分析

【目的】开花基因座T(Flowering Locus T,FT)基因广泛参与植物的生长发育,在调控开花、地下茎发育、种子萌发和逆境胁迫等过程中发挥重要作用。揭示FT基因在中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Roem）中的表达模式和功能可为中国水仙花期调控提供理论依据。【方法】基于中国水仙转录组数据,对FT基因进行筛选,获得4个中国水仙FT基因。利用荧光定量PCR技术分析它们在中国水仙不同组织和花芽分化不同时期的表达模式,并在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中超量表达。利用荧光定量PCR技术分析转NtFT1和NtFT4基因拟南芥中SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1(SOC1)、 LEAFY(LFY)和APETALA 1(AP1)基因表达水平。【结果】克隆了4个中国水仙FT同源基因Nt FT1、NtFT2、NtFT3和NtFT4,除NtFT3外,中国水仙NtFT都具有FT的保守基序;系统进化分析显示,NtFT1属于FT-like I进化枝,NtFT2、NtFT3和NtFT4同属于FT-like ...     

水稻白叶枯病菌tatB基因的克隆及功能分析

根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外纤维素酶产生和生物膜形成。     

水稻基因OsVDAC3的逆境功能分析

水稻OsVDAC3是编码一个可能12次跨膜的线粒体基因,芯片数据显示该基因在水稻根和花器官中表达最强,并受干旱、盐及多种激素显著诱导。以T1代OsVDAC3超表达转基因植株为材料,实时荧光定量PCR技术检测植株中基因OsVDAC3的表达水平,筛选超表达家系进行盐胁迫和甘露醇胁迫试验,结果显示超表达OsVDAC3能显著增强水稻的抗逆性,表明OsVDAC3是水稻逆境胁迫中的正调控因子。     

玉米蔗糖合酶基因启动子的克隆及功能分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,Su Sy)是植物蔗糖代谢中的一类关键酶,在植物的生长发育过程中具有重要功能。以玉米自交系"B73"的基因组DNA为材料,通过PCR扩增出玉米蔗糖合酶基因SH1起始密码子上游1853 bp序列。生物信息学结果显示该序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与干旱诱导的MYB结合位点,根、胚乳等器官表达响应元件。构建了由SH1启动子驱动报告基因Gus的植物表达载体,通过农杆菌介导法产生了水稻转化株系,Southern印迹结果显示获得了单拷贝的"中花11"转基因植株(PSH1)。组织化学分析和实时荧光定量PCR结果表明,Gus基因在根、茎、叶、叶鞘及颍壳中高效表达,但在花和种子中不表达。综上可知,SH1启动子是一个新颖的营养器官特异型启动子,在作物的品质改良中具有良好的应用前景。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中一个Ⅲ型聚酮合酶基因的克隆及功能分析

从链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158基因组中克隆到1个聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）基因orf18。生物信息学及进化树分析表明它可能属于rppA类Ⅲ型PKS基因。通过RT-PCR证实了该基因在野生型S.sahachiroi中是可以进行转录表达的。HPLC和LC-MS分析的结果表明orf18在S.lividans中异源表达时可产生1,3,6,8-四羟基萘(THN),并且发现该基因也可以在革兰氏阴性菌Pseudomonas stutzeri中异源表达并产生明显的棕红色色素。证明orf18编码的蛋白属于RppA类Ⅲ型PKS,可催化THN的合成,而产物THN在革兰氏阴性菌P.stutzeri中可进一步氧化及聚合形成棕红色色素。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅱ型聚酮合酶基因sahA的功能分析

以酮基合酶基因KSa的简并性引物对Streptomyces sahachiroi基因组进行扩增,发现除了已知的阿嗪霉素B生物合成基因簇以外,还存在一个潜在的聚酮合酶(PKS)基因sahA.对sahA编码的氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,结果表明,sahA属于Ⅱ型聚酮合酶基因家族,与合成孢子色素的基因亲缘关系较近.通过单交换中断sahA基因后,链霉菌孢子的颜色由铅灰色变为白色,而产孢时间、孢子的产量以及其抗紫外线的能力都没有变化,对抗生素阿嗪霉素B的产量也没有影响.初步证实这个潜在的Ⅱ型聚酮合酶基因sahA很可能与S.sahachiroi孢子色素的生物合成有关.     

水稻抗倒伏候选基因的鉴定与功能分析

为进一步挖掘控制水稻抗倒伏的基因,以524份水稻种质资源为材料,采用GWAS（genome-wide association analysis）鉴定与抗倒伏性状显著关联的位点qRLG7,通过基因表达水平分析和候选基因关联分析确定调控水稻抗倒伏性的候选基因,在分析候选基因的表达特征和启动子区自然变异基础上利用CRISPR-Cas9技术构建2个候选基因的突变体家系,考察转基因材料的抗倒伏性状。结果显示,编码肌醇-1-单磷酸酶的2个串联排列基因LOC_Os07g37220和LOC_Os07g37230在离茎秆基部5 cm节间中的表达量显著高于其余候选基因,而且这2个候选基因的表达量在极端抗倒伏和易倒伏2组材料中存在极显著差异;通过候选基因关联分析发现这2个基因启动子区的SNP与离基部5 cm茎秆直径（CD5）的表型值显著关联,且基于显著关联SNP的2种单倍型的CD5表型值存在显著差异,这2个候选基因的2种单倍型启动子活性检测结果也表明2种单倍型之间存在极显著差异;2个基因的功能缺失突变体植株在基部节间抗折力、茎秆厚度、茎秆直径以及株高和穗质量等性状方面与野生型对照存在显著差异。结果表明,候选基因LOC_Os07g37220和LOC_Os07g37230具有一定的抗倒伏功能。     

异源表达Hvsusiba2基因水稻的淀粉含量及相关酶谱分析

Hvsusiba2是一个来源于大麦的糖信号转录因子,它作用于淀粉合成途径的上游,是大麦淀粉合成途径的关键调控因子。本研究利用前期研究获得的转Hvsusiba2水稻纯合株系,探讨Hvsusiba2转录因子过表达对水稻淀粉合成的影响,并通过酶谱分析方法分析Hvsusiba2在水稻中的异源表达对支链淀粉合成同工酶的调控作用。结果显示:Hvsusiba2在水稻中的异源表达能够提高籽粒中总淀粉含量,增加淀粉含量达4.33%~9.22%,茎鞘的淀粉含量提高1倍,幼嫩种子发育过程中淀粉累积快速增加期为花后15d起。对该时期的支链淀粉合成酶同工酶分析提示异源表达Hvsusiba2是通过提高籽粒中淀粉分支酶中淀粉分支酶SBEIIb、淀粉分支酶SBEI、异淀粉酶Isoamylase以及淀粉酶Amylase的活性改变水稻的支链淀粉合成,但淀粉分支酶中SBEIIa的活性不受Hvsusiba2转录因子的调控。     

水稻SIDP301基因的克隆与功能分析

水稻是一种非常重要农业粮食作物,属于单子叶植物,对其进行抗逆相关基因克隆功能分析有非常重要理论意义,水稻SIDP301基因编码蛋白质含有锌指结构域,数据表明基因在水稻各个组织中都有一定表达,根和叶水平比较高,基因受到高盐和高温诱导,对照相比可以发现基因耐盐性不是非常明显,抑制基因高盐具有高敏感检测相关标记基因,在抑制超量转基因表达中高于野生型植株,是一个抗逆相关基因,会降低水稻抗逆性。     

水稻耐低氮基因OsTPP6的鉴定及功能分析

[目的]本文旨在研究新的高效利用氮素基因,以改良水稻品种.[方法]通过对117份水稻地方品种的耐低氮表型进行全基因组关联分析(GWAS),鉴定了1个水稻氮素利用相关基因OsTPP6,对野生型'Dongjin'和OsTPP6 T-DNA插入突变体进行氮素利用相关基因的差异表达,及对硝态氮的响应和硝态氮15 N吸收速率进行...     

白菜BrYUCCA5.1基因表达和生物信息学及功能分析

[目的]本文旨在研究白菜YUCCA家族基因BrYUCCA5.1在结球白菜和不结球白菜叶片中的表达模式,并探索其在白菜叶片发育中的作用.[方法]利用生物信息学软件对BrYUCCA5.1基因的进化关系、编码蛋白质的保守结构域、蛋白质的理化性质等特性进行分析;利用实时荧光定量PCR检测结球白菜W30和不结球白菜082及其F2...     

大豆转录因子基因GmMYBZ2的表达及功能分析

MYB转录因子是植物中极为重要的一类反式作用因子,它广泛参与植物的生长、发育、生理代谢的调控以及环境因子的应答.利用RACE-PCR的方法从大豆中分离获得了1个新的MYB基因GmMYBZ2(GenBank登录号:DQ902861).瞬时表达结果表明,GmMYBZ2蛋白定位于细胞核中;对胁迫应答的检测结果显示,在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)等条件下,随着处理时间的增长,大豆品种中豆27中GmMYBZ2的表达量明显降低;而在GmMYBZ2的转化烟草中,总黄酮的含量减少.推测GmMYBZ2可能通过对类黄酮生物合成的调控参与植物的基础生理代谢.     

陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析

【目的】克隆陆地棉开花促进因子家族的一个基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并对其时空表达模式进行研究,解析其在开花调控过程中的作用,为创制早熟陆地棉材料奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中的序列,用Oligo7软件设计引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA为模板,克隆获得Gh FLP5。在Ex PASy网站上预测其蛋白的理化性质,同时在NCBI中检索其他物种中的FPF蛋白,使用Clustal X2进行多重序列比对,并用MEGA6构建系统进化树;取陆地棉早熟品种CCRI50和中晚熟品种鲁棉研28(Lu28)不同生长时期、不同组织的样品,对Gh FLP5的时间和空间表达模式进行分析;从基因组数据库中调取Gh FLP5起始密码子上游1 500 bp的片段,用Plant CARE在线工具预测其顺式作用元件,选取相关激素对二叶期棉花幼苗进行叶面喷施处理,研究Gh FLP5的应答反应;构建植物表达载体p BI121-Gh FLP5,转化拟南芥,观察转基因株系的表型,并用q RT-PCR对其内源基因表达的变化进行测定。【结果】Gh FLP5开放阅读框长300 bp,编码的蛋白质分子量为11.4 k D,共包含3个比较保守的区域,与大豆、苜蓿和毛果杨的开花促进因子亲缘关系较近。空间表达模式分析表明,Gh FLP5在叶片中优势表达,且在早熟品种CCRI50中的表达量显著高于晚熟品种Lu28;时间表达模式分析表明,在CCRI50中其表达量高峰出现在三叶期,而在Lu28中四叶期表达量最高。Gh FLP5的启动子上主要存在两大类顺式作用元件,一类是光响应元件和生物钟元件,一类是胁迫响应元件。根据顺式作用元件的分布和功能选取水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)喷施处理棉花幼苗,结果表明,Gh FLP5能响应外源SA和ABA而上调,也会被外施JA抑制。组成型表达Gh FLP5的拟南芥株系抽薹时间提前约9 d,开花时间提前约7 d,莲座叶数目减少,差异达到极显著水平。荧光定量的结果表明转基因拟南芥中促进开花的基因LEAFY(At LFY)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(At SOC1)、FLOWERING LOCUS T(At FT)、APETALA1(At AP1)和FRUITFULL(At FUL)表达量显著升高,抑制开花的基因Flowering Locus C(At FLC)表达量显著降低。在转基因拟南芥中生长素应答基因SMALL AUXIN UPREGULATED 20(At SAUR20)和SMALL AUXIN UPREGULATED22(At SAUR22)显著上调,具有生物活性的赤霉素(GA)合成的相关基因GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1(GA20OX1)的表达量提高2倍。【结论】转基因拟南芥早花表型明显,Gh FLP5可能在调控中发挥了双重作用,通过IAA和GA途径促进拟南芥的开花转型。     

蝙蝠TRAIL基因的克隆·表达及生物学功能分析

[目的]克隆蝙蝠TRAIL基因,构建蝙蝠可溶性TRAIL原核表达栽体,研究其对肿瘤细胞凋亡的影响.[方法]通过RT-PCR技术克隆蝙蝠TRAIL的全长cDNA序列,实时荧光定量PCR鉴定其组织分布,将其可溶性片段与表达载体pET43.1a连接,并在大肠杆菌BL21中高效表达和纯化,通过western blotting证实.体外,通过MTT、TrypanBlue和流式细胞术检测纯化的可溶性TRAIL蛋白能否诱导肿瘤细胞的凋亡.[结果]成功克隆蝙蝠TRAIL基因,构建了重组表达载体,获得可溶性TRAIL蛋白.体外试验证明,可溶性蝙蝠TRAIL蛋白能够诱导Jurkat细胞和HeLa细胞的凋亡.[结论]可溶性蝙蝠TRAIL蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡,该研究为蝙蝠免疫系统的研究奠定了基础.     

水稻叶片融合基因LF1的图位克隆及功能分析

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能,为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础.[方法]lf1为水稻品种'02428'组织培养获得的叶片融合突变体.利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种'N22'构建遗传分离群体,精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因,经基因敲除克隆LF1...     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

水稻OsBI-1L-8基因启动子功能分析

【目的】分析水稻OsBI-1L-8基因启动子的结构与功能,解析OsBI-1L-8基因的表达特性及生物学功能,进一步了解OsBI-1L家族在水稻生命进程中的作用机理。【方法】利用BDGP、Softberry及Promoter 2.0预测分析水稻OsBI-1L-8启动子大小,以日本晴基因DNA为模板扩增pOsBI-1L-8,PlantCARE分析序列中顺序调控元件。构建pOsBI-1L-8::GUS载体,导入水稻,组织化学染色法检测pOsBI-1L-8在水稻中的时空表达特征。【结果】通过预测分析并克隆pOsBI-1L-8长度为1 258 bp,该区域含有光信号、缺氧胁迫应答及激素调节等顺式作用元件。pOsBI-1L-8驱动的GUS报告基因仅表达于水稻抽穗期的茎结合部位、根茎过渡区和雄蕊。【结论】pOsBI-1L-8为组织特异型启动子,推测OsBI-1L-8可能在水稻生长及雄蕊发育中起重要作用。