“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，由南京林业大学森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2小时。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DIG-F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。     

疫木切面上松材线虫抗原的免疫学检测方法

利用抗松材线虫血清建立在疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方法。ELISA和免疫斑点印迹的结果表明:该方法对松材线虫具有较好的特异性,可以检测出木材表面0·1μg的线虫抗原,显示了较好灵敏度。自然感染松材线虫的黑松疫木免疫组化的染色结果表明:该方法可以清晰地检出管胞处松材线虫蛋白抗原的存在。     

应用特异引物组合检测松材线虫

采用特异引物组合对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测。结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条860 bp的清晰、明亮的条带,而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物。利用此特异引物组合构建了松材线虫检测试剂盒。采用本试剂盒可以在较短时间内对线虫进行鉴定。整个检测过程约需3 h,实现了对松材线虫的快速检测目标。检测结果便于判读,适合于生产上应用。     

疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径     

松材线虫rDNA-ITS2的TaqMan探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 ,DNA测序结果与实时荧光PCR结果一致     

松材线虫病双基因检测方法的建立

采用松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及cathepsin L-like cysteine proteinase为目的片段设计2对引物,建立了可特异性检测松材线虫的双基因PCR检测法.利用这2对引物,松材线虫可扩增出大小分别为490 bp及264 bp的产物,而其他对照组均无扩增.此检测方法经过实际应用检验,灵敏度与...     

日本的抗松材线虫育种研究

经历20世纪六七十年代松树大面积枯死威胁之后,日本在不断探索对该病的防治方法的同时,寄希望于培育抗松材线虫的松树苗木。始于1973年的抗松材线虫育种,从松树造林材料的遗传改良、国内外松树对松材线虫的抗性、抗性检测方法以及抗性育种的可行性等方面进行了大量的研究。文中从抗松材线虫育种的历史背景、抗性判定方法、树种变异、选择育种、杂交育种等方面叙述了日本抗松材线虫育种的情况。     

国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的RAPD分析

采用SDS法提取线虫基因组DNA,分别选取了6种随机引物对部分地区的10株松材线虫和10株拟松材线虫进行随机扩增和亲缘关系比较。RAPD的结果可以明显区分松材线虫和拟松材线虫,与形态学分类相吻合。聚类分析的结果也表明,线虫种内和种间均存在差异,但种间差异明显大于种内差异,同种线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区,同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小。该方法具有所需样品量少、检测灵敏度高、结果准确等优点,为松材线虫种群的亲缘关系、传播途径及其检测防疫等方面提供一种灵敏、可靠的研究方法。     

松材线虫SCAR标记与检测技术

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’),反向引物为M05R1(5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。     

免疫磁性捕获ELISA技术在松材线虫检测中的应用

本研究采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球,并以兔抗松材线虫IgG致敏,制备出能特异性地捕获松材线虫蛋白抗原的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体,并结合酶标亲和素检测系统,用于疫木样品的分析。利用该方法对采自不同地区的3种松树,其中松材线虫病木17株、拟松材线虫病木5株和健木3株进行检测。实验结果表明,虽然拟松材线虫病木也呈现了一定的交叉反应,但疫木中松材线虫总检出率为94.1%,灵敏度达到0.1μg.mL-1线虫蛋白抗原。研究表明免疫磁性捕获ELISA技术可直接捕获木屑中的微量线虫抗原,具有简便、快速、准确等优点,是一种实用的松材线虫的快速检疫方法。     

基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术

拟松材线虫与松材线虫的亲缘关系极为接近,是松材线虫病病原鉴定的主要干扰物种。为了排除松材线虫病病原鉴定过程中拟松材线虫的干扰,采用TaqMan实时荧光PCR技术,以核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为模板设计拟松材线虫特异性引物和TaqMan探针,开展拟松材线虫分子检测和鉴定技术研究。结果表明:拟松材线虫ITS2区域存在较多的碱基差异,以此为模板设计的拟松材线虫引物和TaqMan探针组合具有较强的特异性;该组合灵敏性高,能够实现对拟松材线虫单条线虫甚至单个卵的分子检测和鉴定。结合现有的松材线虫分子鉴定技术,可以为进一步构建松材线虫双重检测技术体系奠定基础,为林业和海关检疫提供可靠的技术支撑。     

松材线虫病的防控

本文对松材线虫病及其媒介昆虫的国内外防治方法进行了综述。分析了松材线虫防治防控中存在的问题,提出了增强松材线虫防治防控效率的策略,以期降低松材线虫疫病的发生率。     

拟松材线虫研究进展

松材线虫和拟松材线虫共同构成松材线虫复合群体,为松材线虫病的病原物。拟松材线虫危害过去没有引起足够重视,相关研究工作不如松材线虫细致。近年来,随着拟松材线虫致病性增强现象不断被报道,人们逐步加强了拟松材线虫研究。本文从拟松材线虫分类学特征、致病性研究及与松材线虫关系等角度对拟松材线虫研究进展进行综述,并展望未来可能的研究热点。     

（拟）松材线虫耐久型四龄幼虫（LⅣ）的形态及其分化变异

本文对浙江省宁波市松材线虫病疫区内的松材线虫和拟松材线虫的耐久型四龄幼虫(LⅣ)的形态及其分化变异作了观察研究.结果表明,松墨天牛成虫体内携带的松材线虫和拟松材线虫的LⅣ在形态上完全相同;同一来源的(拟)松材线虫的LⅣ既可发育形成松材线虫,也可形成拟松材线虫.它的分化变异结果受寄主等环境因子影响,规律是:带尾尖突的LⅣ离开松墨天牛成虫进入黑松多变为无尾尖突的松材线虫;进入马尾松多变为带尾尖突的拟松材线虫.     

大连黑松松材线虫的调查、分离与鉴定

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,该病由松材线虫引起,目前国内外尚无很好的根除方法,加强病害的早期诊断和检测技术尤为重要。文章首次以辽宁省大连市黑松枯死的7个典型地区作为样地进行取样调查,经形态观察和分子生物学方法对病原线虫进行综合鉴定,结果表明,494个黑松样本松材线虫侵染率平均为16.0%。     

松材线虫基因研究进展

对目前松材线虫基因水平的研究进行了概述.目前已研究过的松材线虫基因主要分为三个方面:一是应用于检疫检验的研究,主要研究的基因有rRNA基因,利用rRNA的ITS区核苷酸序列进化速度较快的特点,能准确区分松材线虫与其近缘种;二是探讨致病机理的研究,主要研究了纤维素酶和果胶酸裂解酶等在食道腺细胞中表达的酶基因,发现纤维素酶基因可能是由于基因横跨作用从细菌迁移到松材线虫基因组内,有助于研究松材线虫致病性的起源;三是对松材线虫生长发育相关基因的研究,为控制松材线虫的生长发育提供了依据.     

高压脉冲电流对松材线虫活力和繁殖的影响

研究高压脉冲电流对松材线虫活力和繁殖的影响.结果表明:高压脉冲电流可杀死松材线虫,能抑制松材线虫的迁移扩散能力,脉冲宽度越大,脉冲个数越多,电处理间隔越短,对松材线虫活力影响越强,脉冲宽度和电处理间隔为影响松材线虫活力的主要因子;高压脉冲电流可抑制松材线虫繁殖,脉冲宽度越大,电处理时间越长,对松材线虫的繁殖抑制作用越强;不同龄期的松材线虫对高压脉冲电流的反应不同,成虫对高压脉冲电流的抗性更强,尤以雌虫更具抗性.     

松材线虫和拟松材线虫不同株系线粒体DNA RAPD分析

对松材线虫7个株系和拟松材线虫2个株系的线粒体DNA随机扩增多态性分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的变异性,但种间变异明显大于种内变异,因而支持将松材线虫和拟松材线虫划分为两个不同的种.两个拟松材线虫株系(法国株系和日本株系)之间的相似值和松材线虫各株系间的相似值极为接近,由此看来,这两个株系的变异为种内变异,应同属于一个种.聚类分析的结果表明,松材线虫和拟松材线虫系两个明显不同的类群,即松材线虫类群和拟松材线虫类群.松材线虫类群又分为两个亚组,一个是以日本株系为代表,另一个是以北美洲(美国和加拿大)株系为代表.     

松材线虫与拟松材线虫杂交试验及后代繁殖力研究

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus和拟松材线虫B.mucronatus是伞滑刃属内两个独立的种,均可引起松材线虫病。松材线虫与拟松材线虫能否进行种间杂交在学术界一直存在争议。采用4个虫株在实验室条件下开展了杂交试验及杂交后代繁殖力研究。结果表明:实验室条件下松材线虫和拟松材线虫可成功杂交,他们之间未发展出严格的生殖隔离,二者极可能来源于同一祖先。     

松材线虫与拟松材线虫杂交及后代的致病性

收集松材线虫5虫株与拟松材线虫1虫株进行生物学杂交,结果显示:松材线虫各虫株均能与拟松材线虫杂交且杂交率均较高,但杂交后代中普遍存在线虫死亡率较高的现象.用杂交后代线虫与未杂交亲本线虫分别接种2年生马尾松苗,结果表明杂交后代线虫对接种松苗的致病性小于其未杂交亲本线虫,从接种后萎蔫的松苗中再分离线虫,杂交后代线虫再分离数远少于亲本线虫数.