油茶丙酮酸激酶基因全长cDNA克隆及序列分析

丙酮酸激酶是糖酵解途径的关键酶,在油料作物脂肪酸合成中有重要作用。在实验室构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶PK基因的全长cDNA克隆。该基因序列长2 114 bp,开放读码框为1 737 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量为63 766.5 Da,分子式为C2774H4470N784O875S30,与其他植物的PK基因具有较高的相似性。PK基因系统进化树表明,油茶与蓖麻、杨树、葡萄的亲缘关系最近。     

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

油茶SAD基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析

油茶( Camellia oleifera )是原产于我国的重要木本油料树种,广泛分布于我国南方,总面积达350万hm 2,种仁含油率约为55%.所产茶油富含90%以上的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸,还含有少量的亚麻酸等高价不饱和脂肪酸(胡芳名等,2006),是易消化耐贮藏的优质食用植物油,其油质甚至一定程度上优于橄榄油.     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析

FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因.在构建的油茶.EST文库基础上,采用5'RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆.该基因序列长1 682 bp,开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征.经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性.     

油桐LEC1基因的cDNA克隆与序列分析

为了解LEC1(Leafy Cotyledon 1)基因对油桐油脂合成过程的调控机理,以油桐种仁转录组数据库中基因的部分c DNA序列为基础,采用RT-PCR技术从油桐种子中克隆LEC1基因的全长c DNA,并对其进行序列分析。油桐LEC1基因全长c DNA为1 152 bp,编码区为729 bp(142~870),编码243个氨基酸,5′端非编码区和3′端非编码区分别为141 bp和263 bp。该基因编码蛋白质的相对分子质量为27 025.4 Da,理论等电点为6.97;蛋白二级结构以不规则卷曲和α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。经对比发现,油桐LEC1具有典型的HAP3结构特点,在不保守的N端和C端中间有1个十分保守的结构域,与拟南芥、玉米、麻风树、黄连木等的LEC1氨基酸序列高度同源。     

杨树木质素合成酶hct基因的克隆及核苷酸序列分析

根据毛果杨全序列（AC185363.2）中唯一具有转移酶功能的保守区设计引物,以正在分化的2年生欧美杨107次生木质部总RNA为模板经RT-PCR扩增出hct基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为709bp,包含一个708bp的开放阅读框,与毛果杨全序列及HCT2（EU603314）的同源性均为98%,编码的氨基酸序列与毛果杨HCT2氨基酸（ACC63883.1）的同源性为98%,断定我们克隆的cDNA为hct,属于转移酶超家族,GenBank登录号为FM202091,该重组质粒命名为pMD20-T-hct。     

油桐油体蛋白基因的克隆及序列分析

油桐油体蛋白与油桐脂肪酸储藏密切相关。通过构建油桐cDNA文库和EST文库,用分子生物学手段分离克隆出两个油桐油体蛋白基因的全长cDNA序列。通过分析表明,两个油体蛋白基因的全长cDNA分别为738 bp、838 bp,各包含1个完整的CDS,分别编码137个、154个氨基酸。分别命名为VF_oleⅠ,VF_oleⅡ。通过与其它物种的19条油体蛋白氨基酸序列比对,油桐油体蛋白基因分别与麻疯树oleosin 3和麻疯树oleosin 2的相似性最高,分别为84%、82%。通过软件预测表明,油桐油体蛋白等电点分别为10.315、10.335,都存在跨膜结构域,且存在信号肽剪切位点,中部都存在一个较长的疏水区,C末端都是以α-螺旋为主。     

杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出HDR基因的cDNA克隆,命名为EuHDR。EuHDR基因cDNA全长1 653 bp,5’端非编码区长82 bp,3’端非编码区长188 bp,编码460个氨基酸,与喜树HDR基因序列相似性最高,达82%;推导EuHDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A33)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A117,A208,A262,A345);EuHDR蛋白二级结构α-螺旋占35.65%,β-折叠占19.78%,螺环结构占44.57%;EuHDR蛋白三级结构为单体形式,呈不规则的三叶草形状;系统进化分析表明EuHDR蛋白与葡萄HDR蛋白的亲缘关系最为接近。     

油茶氧化鲨烯环化酶基因序列分析

氧化鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclase,OSC）是甾醇和三萜合成的关键酶之一。以油茶（Camellia oleifera）未成熟种仁为材料进行转录组分析,并鉴定出4个OSC基因,分别命名为CoOSC1/CoCAS、CoOSC2/CobAS、CoOSC3/CoLAS及CoOSC4/CoaAS,CoOSC1和CoOSC2为全长序列。 OSC系统进化树表明,CoOSC1为环阿屯醇合成酶、CoOSC2为β-香树素合成酶、CoOSC3为羊毛甾醇合成酶、CoOSC4为α-香树素合成酶。     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C₃型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。     

油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表达载体构建

α-桐酸合成酶是控制亚油酸向α-桐酸(18:3Δ9cis,11trans,13trans)转化的关键酶。本研究以发育中的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α-桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,长度为1221bp。通过生物信息学分析结果表明,该序列5’端和3’端非编码区序列长度分别为13bp和47bp,含有一个开放阅读框(14～1174bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域。将所得基因经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建反义表达载体pBI121fadx。     

黄皮LEAFY同源基因的克隆与序列分析

LEAFY(简写为LFY)同源基因是控制花分生组织形成的基因之一,并调控植物开花的时间(Weigel et al.,1992),是开花启动所必需的,处于成花相关基因网络中比较关键的位置,为转入生殖发育的中心调节剂,LFY基因不仅参与花分生组织属性的决定,还对抑制成花的EMF基因和TFLl基因起负调作用(王利琳等,2004).     

油茶ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB高盐法提取油茶嫩叶总DNA,进行简单重复序列间扩增(ISSR)分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、M g2+浓度、dNTP s浓度、T aqDNA聚合酶用量和是否加入去离子甲酰胺对反应结果的影响.油茶ISSR分析的最适反应体系为:在20μL PCR反应体积中,含20 ng模板DNA,2.5 mm o l.L-1M gC l2,0.2 mm o l.L-1dNTP s,1UT aqDNA聚合酶,0.5pm o l.μL-1引物,1%去离子甲基酰胺.扩增程序为:94℃预变性2 m in;94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸90 s,反应38个循环;最后在72℃延伸7 m in.