宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

为研究猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）NS1基因，建立快速、准确诊断猪细小病毒的方法，减少猪细小病毒造成的损失，笔者克隆了含有NS1基因的片段，并且与已登录猪细小病毒的相应序列进行比较，成功构建了原核表达重组质粒PET 30a／NS1，并在E.coli中进行了诱导表达。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆与原核表达

 根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NSl基因的克隆与原核表达

根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

H9N2亚型禽流感病毒NS1蛋白原核表达载体的构建及表达

为对H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)NS1基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,根据NS1基因合成1对特异性引物,进行PCR扩增,将扩增片段连接至PMD18-T载体,通过序列测定和比对筛选出保真基因克隆;将保真基因克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a-NS1后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中...     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株（PPV-N株）的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列（登录号NC_001718）设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21（DE3）pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达

[目的]克隆金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因,并构建原核表达载体,进行原核表达：方法]设计引物,采用PCR方法扩增FnBP配体结合区基因,BA克隆后,构建了克隆质粒pMD18-FnBP。用BarnHI和EcoRI双酶切pMD18-FnBP和pET28a（＋）,将纯化的基因FnBP亚克隆至pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a-FnBP,并将其转化至大肠杆茼感受态B121（DF3）中,IPTG诱导表达,并对表达产物进行分析。[结果]PCR扩增出1条约370hp的目的片段,表达产物经SDS-PAGE分析,在30kDa处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带．Westem blot分析表明该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。[结论]已成功构建了FnBP配体结合区基因,并在原核细胞中表达。     

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FM-DV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

烟草H2A的序列分析、原核表达载体构建及诱导表达

[目的]对H2A进行序列分析及蛋白结构域分析,并将其克隆入p GEX4T-1原核表达载体进行诱导表达。[方法]以p GADT7-Rec-H2A质粒为模板,通过PCR扩增烟草H2A(3~140 Aa),将其插入原核表达载体p GEX-4T-1中,并将重组载体转入BL21(DE3)中,诱导其表达。[结果]构建了烟草H2A基因全长和p GEX4T-1载体大片段连接的融合表达载体,并成功地诱导其表达。[结论]该研究为运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作进而确定Nt Tkr与蛋白互作的关键结构域奠定了试验基础。     

黑白花奶牛白细胞介素-2基因的克隆和表达

[目的]克隆牛白细胞介素-2基因(IL-2),并观察其在原核细胞中的表达。[方法]应用RT-PCR技术从黑白花奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增编码牛IL-2基因,并将其克隆到pGEX-2T原核表达质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析。[结果]通过RT-PCR扩增获得500 bp的目的片段,所克隆的IL-2基因在原核细胞中成功表达,表达产物为分子量约43 kD的融合蛋白。[结论]该研究为IL-2基因的进一步研究提供了理论依据和物质基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

偏肿革裥菌Lg-mnp1基因克隆及表达研究

[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据.