绿色荧光蛋白“转基因”猪问世

曾培育出我国首例成体体细胞“克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，于2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国、日本之后第四例绿色荧光蛋白转基因猪。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

表达绿色荧光蛋白的猪胚胎生殖细胞分离

以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体，对处于快速增殖期的8株猪胚胎生殖(EG)细胞(4—9代)进行转基因试验。用1μg DNA和2μL LipofecTamine 2000转染EG细胞后，共获得4株转染EGFP基因的EG细胞系(EG—EGFP)，可发出强绿色荧光；EG—EGFP细胞连续培养2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG—EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中，共注射135枚胚胎，其中112枚存活并发育至囊胚(83．0％)；86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞，其中57枚囊胚在内细胞团(ICM)上发现有EG—EGFP细胞。     

绿色荧光蛋白基因标记枯草芽孢杆菌研究

将源于枯草芽孢杆菌168的木糖启动子xylR和来源于载体pGFPuv的gfp基因连接,插入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pIM,成功构建了以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组载体pIM-GFP.转化枯草芽孢杆菌菌株BS523,突变株在荧光显微镜及紫外灯下均观察到较强的绿色荧光,同时PCR鉴定结果正确.表明重组载体pIM-GFP成功转入菌株BS523,并且gfp基因成功表达.     

转人血清白蛋白基因猪的整合与表达

含有猪血清白蛋白测翼序列的微小人血清白蛋白基因,用显微注射法导入猪的基因组中,生产出转人血清白蛋白基因猪,经PCR和Southern杂交检测,有4头活仔整合有人血清白蛋白基因,其中的3头不同程度地表达了人血清白蛋白。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

国内首例绿色荧光蛋白"转基因"克隆猪问世

曾培育出我国首例成体体细胞。克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国．日本之后第4例绿色荧光蛋白转基因猪。     

我国首例绿色荧光转基因克隆猪成功产崽

本刊讯 从东北农业大学获悉,我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪日前成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。有关专家称,这次试验的成功标志着我国通过体细胞核移植技术生产转基因猪已经发展成熟。     

Dot—blot对转DAF基因猪外源基因整合的检测

衰变加速因子（ＤＡＦ）是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白，转入ＤＡＦ基因猪可以作为人器官移植的供体。采用斑点杂交试验（Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ），对经显微注射导入了ｈＤＡＦ闰片段、用聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定的阳性猪所产仔猪３２头进行了整合检测，获得转基因阳性仔猪１４头。说明了Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ可作为转基因动物外源基因整合检测的一种手段。     

绿色荧光蛋白基因标记芒果畸形病病原菌研究

芒果畸形病是世界性的芒果重要病害。采用PEG介导的原生质体转化法用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(pCT74-sGFP)转化芒果畸形病病原菌(Fusarium proliferatum),获得了表达GFP的转化子。转化子经过单孢纯化后连续继代培养仍能发出稳定而强烈的荧光,通过GFP特异性引物PCR扩增转化子基因组获得预期片段,表明GFP基因已成功转入芒果畸形病病原菌基因组中且稳定遗传。GFP标记菌株生长正常,致病性和野生菌丝无差别。获得GFP标记的转化子,为应用发绿色荧光的芒果畸形病病原菌研究病原菌的侵染方式、扩展过程等奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因在植病研究中的应用

综述了绿色荧光蛋白基因在植物病害研究中的应用及进展。重点分析了绿色荧光蛋白基因在病原菌的检测、侵染与定殖、致病基因的表达及构建抗性植株的筛选中的应用,提出了绿色荧光蛋白基因在应用中存在的问题以及在植物病害研究领域展现出的巨大潜力。     

绿色荧光蛋白及其突变体的特征与应用

就GFP及其突变体的性质和GFP作为报告基因,在基因表达、蛋白质定位、蛋白质互作等方面的应用进行了综述。。     

绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用

作为一种新型、方便的报告标记,来自多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP),相对于其他报告蛋白(如β-半乳糖苷酶和萤火虫荧光素酶)在原位、实时动态研究中具有很多优越性,已广泛应用于农作物科学研究的各个领域。就GFP的特性及其在农作物研究中应用作一简要阐述。     

脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID₅₀)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP...     

绿色荧光蛋白在植物上应用研究进展

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋生物多管水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的一种功能独特的生物发光蛋白。能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。随着进一步对绿色荧光蛋白结构及其发光特性的研究,以及对绿色荧光蛋白基因的成功克隆,对多种新型绿色荧光蛋白的成功改造,使对多种目标进行实时监测成为可能。文中综述了绿色荧光蛋白的发展过程、改进及应用的研究进展。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵研究

[目的]为建立稳定、高效的绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术提供依据。[方法]将30只5~8周龄的绿色荧光蛋白转基因小鼠随机平均分成3组,分别腹腔注射5、7.5、10 IU的PMSG,48 h后腹腔注射7.5 IU的HCG,比较不同剂量PMSG对绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵效果的影响。[结果]PMSG剂量为7.5 IU处理组获得的胚胎数明显高于PMSG剂量为5、10 IU处理组,且差异显著(P<0.05)。PMSG剂量为5、7.5、10 IU处理组的小鼠见栓率分别为70%、80%、90%,处理间差异不显著(P>0.05)。随着PMSG剂量的加大,小鼠的子宫充血程度和卵巢体积逐渐增大。[结论]绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术中所用PMSG的最佳剂量为7.5 IU。     

应用重组PCR构建猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白融合基因

膜联蛋白A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在Ca2+存在时能与带负电荷的磷脂结合。最近研究显示,膜联蛋白A2在病毒感染方面发挥了重要作用。本研究应用RT-PCR和PCR方法分别获得了猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。然后用重组PCR技术成功构建了膜联蛋白A2-EGFP融合基因,为研究膜联蛋白A2在病毒感染细胞中的定位和表达,以及病毒和宿主细胞相互作用奠定了基础。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

利用实时荧光P CR技术快速检测玉米籽粒中转基因成分

[目的]利用Taq Man特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分。[方法]外源基因选取具有一定代表性的Ca MV35S启动子、NOS终止子、BAR、Cry IA(b)基因,数据结果由实时荧光定量PCR反应的Ct值判定。[结果]用该方法检测玉米籽粒中未含有转基因成分,可作为结果判定。[结论]该方法在样品量大时极具优势,高效,准确,对环境污染较小。