集胞藻PCC6803蛋白组学研究进展

自集胞藻PCC6803蛋白组学研究工作开展以来,已取得一系列研究成果。这些研究成果主要分为2类：①鉴定了全细胞或亚细胞结构内表达的蛋白质;②发现了许多环境胁迫条件引起的蛋白质差异表达,为理解细胞胁迫反应和蛋白的功能提供了线索。从这2个方面分别对集胞藻PCC6803蛋白组学的研究成果进行简要综述。     

Synechocystis sp. strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进

以Synechocystis sp.strain PCC 6803为实验菌株,设计改良制备定量PCR模板的方法;同时,对Synechocystis sp.strain PCC 6803总RNA的Trizol抽提法进行优化.结果显示,利用改良方法抽提得到的RNA结构更完整;同时,利用改良方法制备的模板可以用于后续定量PCR实验;其中,只有高表达量基因适用于半定量PCR,低表达量基因则需要实时荧光定量PCR检测.     

集胞藻PCC6803中sll1981基因的克隆与表达研究

集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的功能研究存在争议。实验从集胞藻PCC6803基因组中克隆了sll1981基因,将该基因构建到p ET-32a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。结果表明sll1981蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达,利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的sll1981蛋白,蛋白收率约为3 mg/g菌体。研究为今后鉴定sll1981蛋白的真正功能奠定了基础。     

用同源重组法将Δ5 Des整合在集胞藻6803中的表达

从枯草芽孢杆菌染色体中扩增出受冷诱导的Δ5Des去饱和酶,构建出可以与集胞藻PCC6803染色体发生同源双交换的质粒,将Km抗性基因::PpsbA1::Δ5脂肪酸去饱和酶基因和对照基因分别整合入PCC6803的染色体上,获得转化子后,对不饱和脂肪酸进行研究。结果发现,30℃条件下脂肪酸成分的含量发生了较大变化,20℃时有新成分的出现,且长链脂肪酸的含量有所上升。     

02188-8(6803)的特性及栽培技术

02188-8( 6803)是富全新科种业选育的品系,以代号6803参加自治区区试,属高产、稳产、优质、抗病、抗倒的早中熟陆地棉品种. 1 特征特性 该品系生育期136天,植株塔形、松散、清秀;通风透光性好.果枝Ⅰ～Ⅱ型,叶片偏大,叶色浓绿,铃卵圆形,铃壳薄,结铃性强,吐絮集中较畅,易采摘,絮洁白,品质好.苗期生长快,生长势稳健,不早衰.单株成铃8个,单铃重6.4 g,衣分42%,绒长30 mm,比强28.7cN/tex,马克隆值3.9.     

光生物反应器中集胞藻6803的光衰减及其生长动力学研究

[目的]分析集胞藻6803细胞培养体系的光衰减及分批培养条件下藻细胞的生长特性。[方法]以集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）为供试藻种,用尤尼柯7200型分光光度计测定藻细胞浓度和用ST-85自动量程照度计测定光强在通过不同光程、不同浓度藻液时的变化。[结果]随着藻细胞浓度和光程的增加,光强迅速下降。在同一光程下,光强随着藻细胞浓度的增加而下降。在培养初期藻细胞浓度较低时,光衰减程度较小;在培养后期,随着藻细胞浓度的增加,光衰减程度逐渐增加。在培养过程中藻体细胞的生长规律与微生物发酵过程中菌体的生长规律相似。藻体细胞生物量曲线与微生物发酵时的菌体生长曲线相似。[结论]Lambert-Beer公式Ln（I/I0）=-KaXL能较好描述藻细胞浓度和光程对光衰减的综合影响;Logistic方程能很好描述藻细胞的生长曲线。     

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

集胞藻酰基载体蛋白基因过量表达对脂肪酸合成的影响

酰基载体蛋白(ACP)是微生物脂肪酸生物合成途径中的一个关键蛋白。为了促进集胞藻脂肪酸的积累,以集胞藻PCC6803为研究对象,成功构建了用于过量表达ACP(ssl2084)基因的同源重组质粒ssl2084⁽⁺⁾并在集胞藻PCC6803中进行转化。将ssl2084⁽⁺⁾突变株进行DNA水平和蛋白质水平鉴定,结果表明,ssl2084基因已经得到过量表达。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对突变藻株在不同温度下脂肪酸的含量及组分进行检测,发现在30 ℃培养条件下ssl2084⁽⁺⁾突变株中C12:0、C16:0和C18:0的含量显著增加,分别为1.50、8.74和0.60 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了54.71%、50.82%和155.86%;在20 ℃低温胁迫培养条件下,C12:0、C16:0和C18:0的含量分别达到1.70、11.85和2.31 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了31.94%、47.35%和39.90%。以上结果表明,在集胞藻PCC6803中过表达ssl2084基因能提高集胞藻中的中长链脂肪酸的含量,低温条件使得集胞藻中的中长链脂肪酸的含量进一步提高。     

棉花新品种新陆中35号高产栽培要点

高产栽培要点棉花新陆中35号是巴州富全新科种业有限责任公司选育的早中熟陆地棉品种,于2007年通过自治区农作物品种审定委员会审定命名.该品种以代号6803参加自治区区试后,以富全8号在库尔勒、尉犁县主产棉区的良繁农场以及特约良繁地试验示范,多点产量表现突出.     

集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2蛋白多克隆抗体的制备与检测

CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反应;最后,通过Western blot分析证实该多克隆抗体能够特异而灵敏地检测集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2的丰度。     

常见细菌培养物光密度与浓度的关系研究

为建立准确评估细菌培养物浓度和生长状态的方法,分别采用流式细胞仪和分光光度计对实验室常见3种培养物包括大肠杆菌Escherichia coli S17-1、集胞蓝细菌Synechocysitis sp.PCC 6803和枯草芽胞杆菌Bacillius subtilis 168在不同浓度下的细胞数目和光密度进行了测定。随后将每个培养物在系列浓度下的光密度和细胞浓度进行比较,建立了光密度-细胞浓度的函数关系。结果表明,在一定浓度下,3种实验室常见培养物的光密度和细胞浓度呈显著线性正相关。最后,采用拟合函数验证在培养过程中细菌培养物的光密度与细胞浓度的关系。本研究建立了Escherichia coli S17-1、Synechocysitis sp.PCC 6803和Bacillius subtilis 168菌株光密度与细胞浓度的关系,可为相关菌株采用分光光度法判断培养物细胞浓度及下游分子生物学实验的开展奠定基础。     

培养基中几种重要营养元素对Anabaena sp. strain PCC 7120及Synechocystis sp. strain PCC 6803生长的影响

配制KNO3、KHCO3、NaHCO3、FeNa2-EDTA及Na2s2 O3营养盐培养液,并按一定浓度添加至液体或固体培养基中,获得含有不同营养素、不同浓度的液体及固体培养基,检测无机氮(NO3-)、无机碳(HCO3-)、Fe及Na2S2O3对集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803和鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120细胞生长的影响.结果显示,集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803在10 mmol/L硝酸盐生长较好,鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120在2 mmol/L硝酸盐生长较好.不同浓度KHCO3及NaHCO3都会对蓝细菌的生长产生影响,可能是因为盐离子发挥了主要作用.此外,2种蓝细菌在10 mmol/L Na2S2O3中生长较好,不同浓度的铁盐对蓝细菌的生长产生较大影响,在10μmol/L铁盐中生长最佳.     

内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化

利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肤的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肤的自剪切发生,利用几丁质亲和柱纯化到无素和标签的绿色荧光蛋白,得到蛋白有较高的...     

农业部门加强小麦病虫害防控

<正>本报讯受近期气温回升和降水等因素影响,纹枯病、条锈病、蚜虫、麦蜘蛛等小麦主要病虫害发生增长较快,发生程度重于去年同期。目前,全国小麦病虫害累计防治面积6803万亩,其中蚜虫、麦蜘蛛、条锈病、纹枯病和白粉病累计防治面积分别为798万亩、1339万亩、142万亩、4212万亩和310万亩。针对当前小麦病虫害发生日趋加重的态势,各级农业部门积极应对,加大监测防控力度,及早准备药械物资,强化技术指导,全力组织做好防控工作。河南省农     

集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。     

集胞藻6803藻胆体藻蓝蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

通过PCR扩增出集胞藻6803 C-PC编码基因cpcA,构建表达质粒pET32a(+)-cpcA,转化大肠菌株BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达、经His-tag纯化后免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体。间接ELISA法揭示该抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性。应用该抗体进行蛋白免疫印迹检测,结果发现C-PC蛋白在生长光与高光培养条件下的数量,以及与2个光系统间的连结数量均存在显著差异,为进一步研究藻胆体的杆在响应与适应机制中所承担的重要角色奠定了生化基础。     

蓝细菌16S rRNA双甲基化酶基因ksgA的进化分析、蛋白结构预测及功能验证

为研究核糖体小亚基rRNA双甲基化酶基因ksgA的进化关系、蛋白结构和功能,利用MEGA 5.2软件构建了37种蓝细菌ksgA基因和16S rDNA的系统进化树,通过SWISS-MODEL分析和预测KsgA的蛋白质结构模型,并通过克隆集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803、鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC7120和聚球蓝细菌Synechococcus elongates sp.strain PCC 7942的ksgA基因对大肠杆菌ksgA突变体进行了异源互补.结果表明:ksgA基因在蓝细菌中与16S rDNA进化分支高度相似,且体现出蓝细菌进化的聚类特征;蓝细菌KsgA甲基化酶与该蛋白家族的其他蛋白质拥有共同的保守结构、催化位点和配体结合位点;克隆的3种蓝细菌ksgA基因均能在一定程度上互补大肠杆菌ksgA基因的功能.     

集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。     

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferases,PPTase）是细菌脂肪酸合成中的关键酶。本研究利用同源重组手段构建集胞藻PPTase基因（slr0495）过量表达重组质粒,在集胞藻PCC6803中进行表达研究,并在DNA和RNA水平进行验证,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测不同条件下突变藻株脂肪酸组分及含量。结果表明：在温度为30 ℃、光照强度为50 μmol ·m^-2 · s^-1培养条件下,过量表达slr0495基因突变藻株中C12:0、C16:0和C18:0的含量分别为1. 31 mg · g^-1、8.07 mg · g^-1和1.35 mg · g^-1,比野生型藻株分别提高了23.58%、25.31%和13.45%;在温度为20 ℃、50% NaNO₃浓度、光照强度为50 μmol · m^-2 · s^-1培养条件下,与野生型相比,突变藻株中C16:0和C18:0含量分别提高了44.71%和41.51%。以上结果表明,过表达slr0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链饱和脂肪酸的含量,并且在低温（20 ℃）和缺氮（50% NaNO₃）双重胁迫培养条件下中长链饱和脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究slr0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应提供了理论依据,为微藻高产多不饱和脂肪酸代谢研究奠定了基础。     

钝顶节旋藻羧酶体操纵子的克隆与分析

利用高通量测序技术Solexa,测得了钝顶节旋藻AGB-AP02(Arthrospira platensis AGB-AP02)的全基因组序列。在基因组中发现了编码羧酶体的操纵子,这些基因同集胞藻PCC 6803中相应的基因具有较高的同源性,该操纵子在Genebank上的登录号是HM179535。在整个基因组中没有发现编码碳酸酐酶的基因,同时发现蛋白ABT4具有典型的γ-碳酸酐酶N-末端的三维结构与催化活性位点。通过Mega3.1建树分析,蛋白ABT4与M.Thermophila的γ-碳酸酐酶聚在一支。推测ABT4蛋白在羧酶体中同时发挥碳酸酐酶与结构蛋白的作用。