鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)克隆

根据人源大肠杆菌１型菌毛结构基因ＤＮＡ序列,在其保守区设计了１对带有ＢａｍＨ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ酶切位点的引物,经ＰＣＲ扩增,从２４株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到２１个大小约６５７ｂｐ的阳性产物,经酶切、连接、转化及筛选,得到３种来自不同自清型鸡源大肠杆菌ＰＣＲ产物的阳性克隆。经核酸序列测定,确认所克隆的外源基因为１型菌毛ｐｉｌＡ基因。     

Real-time PCR assay for detection of Dickeya fangzhongdai causing bleeding canker of pear disease in China

Bleeding canker, caused by Dickeya fangzhongdai, is a devastating disease of pear in China. The bacterium causes cankers, branch die-back, and eventually kills pear trees. The typical sign of bleeding canker infection is a rusty-brown bacterial ooze that exudes down from cankers onto branches or trunks. However, early symptoms and signs are inconspicuous, which makes effective disease management difficult. Detection and identification of D. fangzhongdai are time-consuming and difficult because no rapid method exists to date. In this study, a Taq Man real-time PCR assay was developed for D. fangzhongdai based on an elongation factor G(fus A) gene. The real-time PCR assay detected 0.2 pg μL~(–1) DNA and 1×10~3 Cfu m L~(–1) of D. fangzhongdai. Based on this assay, bleeding canker on asymptomatic pear trees can be diagnosed as early as 5 days after infection. The real-time PCR assay can facilitate disease management by providing early and accurate diagnosis of the bleeding canker disease of pear.     

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。     

Molecular mapping of YrTZ2, a stripe rust resistance gene in wild emmer accession TZ-2 and its comparative analyses with Aegilops tauschii

Wheat stripe rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), is a devastating disease that can cause severe yield losses. Identification and utilization of stripe rust resistance genes are essential for effective breeding against the disease. Wild emmer accession TZ-2, originally collected from Mount Hermon, Israel, confers near-immunity resistance against several prevailing Pst races in China. A set of 200 F_6:7 recombinant inbred lines (RILs) derived from a cross between susceptible durum wheat cultivar Langdon and TZ-2 was used for stripe rust evaluation. Genetic analysis indicated that the stripe rust resistance of TZ-2 to Pst race CYR34 was controlled by a single dominant gene, temporarily designated YrTZ2. Through bulked segregant analysis (BSA) with SSR markers, YrTZ2 was located on chromosome arm 1BS flanked by Xwmc230 and Xgwm413 with genetic distance of 0.8 cM (distal) and 0.3 cM (proximal), respectively. By applying wheat 90K iSelect SNP genotyping assay, 11 polymorphic loci (consisting of 250 SNP markers) closely linked to YrTZ2 were identified. YrTZ2 was further delimited into a 0.8-cM genetic interval between SNP marker IWB19368 and SSR marker Xgwm413, and co-segregated with SNP marker IWB28744 (co-segregated with 28 SNP). Comparative genomics analyses revealed high level of collinearity between the YrTZ2 genomic region and the orthologous region of Aegilops tauschii 1DS. The genomic region between loci IWB19368 and IWB31649 harboring YrTZ2 is orthologous to a 24.5-Mb genomic region between AT1D0112 and AT1D0150, spanning 15 contigs on chromosome 1DS. The genetic and comparative maps of YrTZ2 provide a framework for map-based cloning and marker-assisted selection of YrTZ2.     

浦东地区部分猪场猪链球菌2型的分离鉴定及耐药性分析

2014年03月至08月期间,对来自浦东地区患关节炎的150份病猪和死猪内脏器官及关节液进行细菌分离,对分离细菌进行革兰氏染色、PCR鉴定、药敏实验和多重PCR检测链球菌毒力因子分布(荚膜多糖cps、溶菌酶释放蛋白基因mrp、胞外因子ef、溶血素sly、毒力相关基因orf2、谷氨酸脱氢酶基因gdh、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapdh),并对链球菌2型cps基因序列进行进化树分析。结果,从分离到的120株细菌中检测到21株链球菌,分离率为17.5%,2型链球菌分离率为11.67%;链球菌的毒力型呈-/+cps2J-/+mrp-ef-sly-gdh-/+gadph-/+orf2;分离株呈多重耐药性,耐药性为:大环内酯类硝基呋喃类、氯霉素类、多肽类、氨基糖苷类、四环素类青霉素类、头孢菌素类、亏诺酮类林可胺类、磺胺类;cps基因与GenBank上已公布的链球菌2型荚膜多糖基因的核苷酸同源性达94%~99%。     

昆虫病原真菌基因组学及多组学研究进展

昆虫病原真菌是重要的生物防治资源,利用昆虫病原真菌防治农业害虫具有不易产生抗性、易造成昆虫病害流行、生态安全环保等优势,推广应用昆虫病原真菌控制害虫是今后生态农业的发展趋势.现代测序技术的飞速发展促进了真菌基因组学的研究,在全基因组测序、系统发育基因组学、比较基因组学以及多组学(转录组学、蛋白组学、代谢组学)联合分析等...     

黄芪中黄芪甲苷的提取工艺优化

[目的]优化黄芪（RADIX ASTRAGALI）中黄芪甲苷的提取工艺。[方法]利用均匀设计法,采用小型工业设备TS-NS提取浓缩机组对黄芪进行提取浓缩,考察乙醇浓度、固液比、提取时间及提取次数对黄芪甲苷提取率的影响,并用HPLC-ELSD测定黄芪甲苷的含量,筛选最佳工艺。[结果]黄芪中黄芪甲苷的最佳提取工艺：乙醇浓度为80%,固液比为1∶8,提取次数为3次,提取时间为1 h。[结论]与现有文献报道的方法相比,优选的黄芪甲苷提取工艺简便、可靠,适合工业化生产。     

鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株与拓扑异构酶IV关系研究

采用常规PCR法,以雏鸡沙门氏菌NCTC5776作为质控菌株,取临床分离的对5种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星)均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA.设计引物parCF和parCR、parEF和parER,分别扩增菌株拓扑异构酶IVparC基因和parE基因的氟喹诺酮类...     

河北省小麦及玉米纹枯病菌生物学特性初步研究

对2005年采自河北省10个县（市）的130株小麦丝核菌及采自6个县（市）的21株玉米丝核菌进行了生物学测定，结果表明不同的培养基成分对病菌的生长有明显的影响，菌株在各种培养基上的生长速度为：PDA培养基〉玉米粉培养基〉水琼脂培养基。在pH值为4～9时丝核菌均能良好生长，pH值为6时生长速度最快；通过番红0．KOH染色观察发现1330株小麦分离菌株中有双核丝核菌122株，占93．85％，多核丝核菌8株。占6．15％；21株玉米分离菌株中双核丝核菌2株，占9．52％，多核丝核菌19株，占90．48％；选取典型的丝核菌菌株进行了盆栽小麦、玉米相互接种的致病性测定，结果表明，不同类型的菌株间致病力强弱存在明显差异，且丝核菌对原寄主的致病力强。     

植物病原细菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000致病基因比较基因组及原核表达分析

番茄细菌性叶斑病是由Pseudomonas syringae pv. tomato引起的一种世界范围内广泛发生的植物细菌性病害,其模式菌株DC3000已完成全基因组测序。试验通过比较基因组学方法将该模式菌株基因组中的致病基因与其他已完成全基因组测序的植物病原细菌的基因组序列进行比对,得到3个DC3000菌株特有的致病基因PSPTO_4707、PSPTO_4708、PSPTO_4711,并对PSPTO_4711基因进行原核表达和蛋白活力检测,发现其表达的活性蛋白对拟南芥具有很强的毒性。     

禽致病性大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研究及其应用

本试验用提取的禽致病性大肠杆菌1型菌毛免疫BALB/c小鼠,筛选获得2株单克隆抗体;经MSHA试验和Western-blot试验证明,它们是1型菌毛,其凝集价分别为25～26、28～29,ELISA效价分别为103、104～105;对46株带有1型菌毛的禽致病性大肠杆菌优势血清型分离株进行了检测,结果表明该单克隆抗体都与之发生特异性反应。     

新株型水稻与杂交稻结实期的光合特性与产量

以穗型较大的3个不同类型水稻品种(组合)新株型稻IR65600-85、二系杂交稻培矮64S/E32和三系杂交稻 优86为材料,研究其结实期干物质生产与分配的比较特性及与产量的关系.结果表明:培矮64S/E32和 优86产量差异不显著,但它们极显著地高于IR65600-85.就单茎物质生产力而言,IR65600-85具有较高的生物产量,归因于其株型紧凑、少蘖大穗、分蘖成穗率高、单茎茎鞘重、光合速率高,但由于抽穗后叶、茎、鞘物质输出受阻,导致功能叶碳氮代谢紊乱,比例失调,使籽粒结实率低、充实差,产量潜力无法发挥.     

鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

根据已发表的大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2(O11)、YR5(O78)、MG12(O18)基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行扩增并与国外同源菌株基因序列进行比对。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNA-STAR软件对fimH蛋白抗原决定簇进行预测分析,发现它们的抗原决定簇基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未对fimH蛋白的抗原结构产生明显影响。     

湖南浓香型产区烟叶口感特性感官评价

为明确湖南浓香型产区烟叶口感特性评价指标的区域状况和空间分布特征,对来自湖南浓香型产区21个主产烟县的44个烟叶样品进行感官评价。结果表明:①湖南浓香型产区烟叶刺激性和干燥感稍有,余味尚净尚舒适。②烟叶刺激性、干燥感和余味地区间差异不显著。③不同县之间刺激性标度值以嘉禾县最低,干燥感标度值以新田县最低,余味标度值以嘉禾县最高。④2012年烟叶刺激性和干燥感标度值极显著高于2011年,但余味在年际间差异不显著。⑤刺激性和干燥感标度值在空间上有从北向南递减的分布趋势,余味标度值在空间上有从南向北递减的分布趋势。⑥根据聚类分析结果将湖南浓香型产区烟叶口感特性分为好、较好和一般3种类型。     

羊乳清蛋白ACE及DPP-IV抑制肽的分离纯化与鉴定

使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对羊乳清蛋白进行水解,分别在不同时间取样,体外测定其ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性。通过中空纤维膜超滤、凝胶过滤层析和反向高效液相色谱（RP-HPLC）的手段对酶解产物进行逐步分离和纯化,评价各级分离产物的生物活性;通过液质联用（LC-MS/MS）的方法鉴定多肽的氨基酸组成,根据质谱结果合成多肽。结果表明：中性蛋白酶水解物具有一定的生物活性,双重活性多肽Pro-Pro-Ala-Ser-Glu-Val-Val-Lys-Pro对ACE和DPP-IV均有抑制作用,其IC₅₀值分别是573.32±4.63和2 065.35±22.30 μmol/L。Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys-Ile-Asp具有较好的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值为964.14±4.09 μmol/L。羊乳清蛋白水解物可以作为食源性材料用于管理伴有高血压的Ⅱ型糖尿病患者的饮食。     

水稻直立穗型的遗传及其对籼稻农艺性状的影响

以直立穗型品系G 83和弯曲穗型温敏核雄性不育系培矮64S为材料进行杂交、测交,获得F1、TC1和F2群体,研究穗型的遗传规律及穗型与茎叶形态性状、穗部性状的关系。结果表明,水稻直立穗型遗传受一对核主效基因控制,直立穗型相对弯曲穗型为显性;直立穗型植株较矮,剑叶短而宽,穗、穗颈节间较短,而弯曲穗型则相反;不同穗型植株有效穗数差异不显著,直立穗型植株的每穗粒数极显著高于弯曲穗型植株,而千粒重、结实率、单株产量则极显著低于弯曲穗型植株。     

Salicylic acid induces the accumulation of defense-related enzymes in Whangkeumbae pear and protects from pear black spot

The ability of salicylic acid (SA) to induce disease resistance was studied with Whangkeumbae pears affected by Alternaria kikuchiana Tanaka. SA (0.02, 0.2 and 2 mmol·L⁻¹ active ingredient) protected Whangkeumbae pear leaves from artificial infection when applied before inoculation. When the concentration of SA reached 0.2 mmol·L⁻¹, the disease-infected index was the lowest, and the rate of induced resistance reached 59.0%. The protection of Whangkeumbae pear leaves was associated with the activation of three defense-related enzymes, SOD, POD and PAL. Accumulation of three enzymes was induced locally in treated leaves and systemically. These results suggested that SA could induce systemic resistance in Whangkeumbae pear leaves by increasing defense-related compounds.     

大棚和露地条件下梨叶片生长发育特性

本研究以翠冠梨和黄冠梨为试材,分析比较了大棚和露地栽培条件下梨叶片生长发育及光合特性。大棚栽培的翠冠梨和黄冠梨的叶片鲜重、叶面积、气孔纵径、海绵组织、叶绿素含量、净光合速率、脯氨酸含量均大于露地栽培的,而气孔密度、叶肉栅栏组织所占比例、栅栏组织和海绵组织的比值、蒸腾速率、氮磷钾含量、丙二醛含量均小于露地栽培的。表明在大棚栽培条件下,梨蒸腾速率降低,净光合速率增加,因此养分积累多,生长量大。     

水稻白叶枯病菌菌落类型及致病力变异研究

在1983～1988年间从182个菲律宾水稻白叶枯病菌菌株和97个中国菌株中获得2万多个单菌落,根据菌落特征(形态,大小,色泽)及在鉴别品种上致病性测定的结果,供试菌株可区分为野生型,突变型和中间型三个类型,野生型代表菌株的原始致病力;突变型不但在菌落特征上有别于野生型,且致病力接近于无毒菌;中间型菌落的特征和致病力均不稳定,多糖体的产生量与病菌菌株的菌落特征及致病力间无明显的规律性可循,突变型菌落的出现频率与致病力有一定关系,但因菌而异,采用低温和冰冻真空干燥保存法、减少移植次数、延长移植间隔时期、选用适宜的培养基有减少突变型菌落而延缓致病力下降的作用。     

大棚设施栽培华酥梨叶片生理生化与结构变化研究

【目的】探讨大棚设施栽培条件下梨叶片结构与光合生理变化,以期为梨设施栽培调控提供理论依据。【方法】以华酥梨为试材,比较大棚设施栽培和露地栽培方式下梨叶片超微结构、光合作用、叶绿素荧光及可溶性糖等生理指标。【结果】大棚设施栽培华酥梨叶片变大、变薄,叶绿素a、b及可溶性糖含量降低,叶片含水量升高,而叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）均较露地栽培有所降低。叶绿素荧光测定结果表明,大棚设施栽培梨叶片光合系统部分损伤,热损耗比例加大,线粒体和叶绿体内基粒数减少、基粒片层松散且变薄,淀粉累积加剧,表现出代谢活性降低,光合产物运转不足。【结论】大棚设施栽培方式下,华酥梨受到高温、弱光胁迫,其叶片质量降低,光合能力降低,光合系统热耗散比例加大,细胞活性降低,正常代谢能力降低。