柱花草SgLPR1基因克隆与表达分析

植物的生长和发育受土壤磷有效性的影响。柱花草(Stylosanthes guianensis)是主要的热带豆科牧草，对低磷胁迫表现出优良的适应性。由LPR基因编码的多铜氧化酶被报道在调控植物根系生长和低磷响应方面发挥重要作用。本研究分析了低磷胁迫对两个柱花草基因型生长的影响，并对SgLPR1基因进行了克隆和表达分析。结果表明：相对柱花草基因型‘TF0285’，‘TF0277’具有较高的植株干重和磷吸收效率，且低磷处理促进了‘TF0277’根系的生长。基因克隆分析表明，SgLPR1基因全长为1 713 bp，编码570个氨基酸残基，蛋白分子量为64.1 kDa，属于Cupredoxin家族成员，亚细胞定位预测SgLPR1蛋白定位于内质网上。实时定量聚合酶链反应(PCR)结果表明，SgLPR1基因在柱花草茎中表达量高于其他组织中的表达量，且在根尖大于1 cm的根段中表达量最高。相比对照处理，缺氮、缺磷和缺钾处理均增加了SgLPR1基因在柱花草叶和根中的表达量。此外，低磷处理增加了SgLPR1基因在柱花草‘TF0277’根中的表达，但其在‘TF0285’根中的表达无显著变化。本研究结果揭示了...     

柱花草在酸性红壤中磷吸收效率及其形态和生理生化特性初探

本文通过盆栽及水培试验对桂花草地上部、根部形态、根际酸化及根、叶酸性磷酸酶活性等生理生化特性的测定,对柱花草基因型适应低磷的机制进行研究,为选育磷高效率基因型提供依据。结果表明,在酸性低磷红壤区,供试的十三个桂花草品种在株高、分枝数、主根长、根系活跃吸收面积及根际酸分泌等方面差异明显。相关分析结果表明,地上部生物量与株高、分校数、主根长和根系活跃吸收面积等形态特征间相关关系明显。在低磷区,根际酸化能力与植株吸磷量之间相关关系显著,表明报际酸化有利于柱花草对磷的吸收。根部和叶部磷酸酶活性与缺磷条件下地上部生物量和植株吸磷量之间无显著相关,进而表明桂花草的磷效率主要是由吸收效率所决定的。     

柱花草生产利用技术现状及展望

通过对柱花草在华南地区主要适宜品种及生产利用技术现状的介绍，阐明了柱花草在发展我国热带亚热带草业生产中的作用，并对柱花草生产利用中存在的耐寒性、土壤酸化、深加工、抗病性和磷高效率基因型品种选育等问题进行了初步探讨。     

柱花草生产利用技术现状及展望

通过对柱花草在华南地区主要适宜品种及生产利用技术现状的介绍,阐明了柱花草在发展我国热带亚热带草业生产中的作用,并对柱花草生产利用中存在的耐寒性、土壤酸化、深加工、抗病性和磷高效率基因型品种选育等问题进行了初步探讨.     

酸性红壤区柱花草磷效率基因型差异

本试验选用十三个不同基因型柱花草品种,通过盆栽试验,比较其营养生长和磷吸收情况。结果表明,在酸性低磷红壤区,品种间的磷效率差异明显,根据其在低磷酸性红壤不同的生长状况,可划分为野生型、栽培型和磷高效率型三种类型。在相同磷水平下,不同基因型柱花草品种的磷含量并无明显差异,基因型间对低磷或高磷的适应能力并不表现在植株含磷量的差异方面,通过计算植株吸磷量和磷效率比值,对磷的吸收效率和利用效率进行比较,前者对磷高效率基因型更为重要。     

不同基因型柱花草的根系构型差异及其磷效率

柱花草是华南坡地果园生草栽培的重要草种,为减轻柱花草与果树的根系养分竞争,有必要筛选根系构型适宜的基因型柱花草。本试验在正常供磷条件下研究了7个基因型柱花草的根系构型特征,发现存在显著的差异,且总根长、主根长和根系表面积与生物量存在显著正相关。根据生物量和根系构型将其分为3类,选择生物量高但基根角度差异大的2个基因型(‘格拉姆’和‘184号’)进行进一步的磷效率比较研究,结果表明基根角度小的‘184号’在高磷条件下具有较高的磷吸收效率,但在低磷条件下的磷吸收效率较低,从而导致其磷效率较低。本研究表明,基根角度是影响磷吸收效率的重要因子,但是磷效率还取决于低磷条件下的生长表现;‘格拉姆’可能比‘184号’更适于用作果园间作。     

柱花草磷转运蛋白SgPT1的克隆和表达分析

磷是植物生长所必需的大量元素。高亲和磷转运子是控制植物对磷吸收和转运的主要蛋白。本研究以磷高效的柱花草基因型TPRC2001-1为对象,首先建立低磷胁迫下TPRC2001-1根系全长cDNA文库。通过同源克隆的方法,首次克隆到编码柱花草高亲和磷转运蛋白的基因,SgPT1。该基因全长cDNA为1 994 bp,编码538个氨基酸残基,蛋白分子量为59 kD。SgPT1蛋白具有高亲和磷转运子的结构特点,即含有“6+6”跨膜结构。而且,定量PCR分析结果表明低磷胁迫显著促进SgPT1在根部的表达,表明该基因可能参与低磷胁迫下磷的吸收和转运的过程。总之,以上结果表明SgPT1的加强表达可能是TPRC2001-1适应低磷胁迫的分子机制之一,为进一步研究柱花草适应低磷的分子机制提供候选基因。     

解磷细菌接种对热研2号柱花草生长与土壤酸化的效应

将热带牧草根际筛选出的2株高效解磷细菌接种到热研2号柱花草根际进行盆栽试验,结果表明,2株解磷细菌GI26和GI943均可以高效溶解难溶性磷酸盐,尤其在低磷胁迫下,可有效提高热研2号柱花草根际和土壤的pH值,从而在一定程度上减缓热研2号柱花草种植过程中导致的土壤酸化现象;同时,2株解磷细菌均能显著促进柱花草的植株生长和生物量、植株磷素营养积累、土壤有效磷含量的提高,尤其是株高和植物含磷量。     

土壤磷水平对柱花草株高、根长及生物量的影响

通过对8个柱花草品种(系)进行4个不同磷水平处理,在收获前对柱花草的生长情况进行调查,分别测量其株高、主根长和单株生物量,研究土壤磷水平对柱花草株高、根长及生物量的影响,旨在初步筛选耐低磷的柱花草品种(系)。结果表明:随着施磷量的减少,各柱花草品种(系)的平均株高、主根长和单株生物量总体呈下降趋势。其中,1号品种即西卡柱花草最耐低磷,5号品种即热研5号柱花草较耐低磷,7号柱花草即GC1463品系最不耐低磷。     

不同施磷浓度对柱花草和黑籽雀稗根系分布的影响

采用根箱法,结合Winrhizo2004a根系扫描测定系统,以豆科牧草柱花草和禾本科牧草黑籽雀稗为试验材料,研究不同施磷水平对柱花草和黑籽雀稗根系分布的影响。结果表明,2种牧草根系分布随土壤深度的增加而减少, 柱花草集中分布于0～10 cm土层, 黑籽雀稗集中分布于0～20 cm土层;磷对2种牧草根系生长的影响存在较大的差异。低磷(P1,0.48 g P₂O₅/kg土)更适合柱花草根系和地上部分的生长,高磷(P3,1.92 g P₂O₅/kg土)水平对根系生长有抑制。黑籽雀稗对磷的需求量大,随着磷施入量的增加,根干重、总根长、根表面积、体积和根系平均直径均有所提高。     

柱花草根系分泌物对缺磷胁迫的响应分析

为探索柱花草(Stylosanthes guianensis)根系分泌物对缺磷胁迫的响应，本研究以‘热研5号’柱花草为材料，通过水培试验，分析了正常供磷(+P)和缺磷(-P)处理对柱花草生长及根系分泌物的影响。结果表明，相对于+P处理，-P处理显著降低了柱花草植株干重和全磷含量。随后，代谢组共检测到101个根系分泌代谢物，可被分为有机酸、氨基酸、类黄酮、糖及醇类等七类，其中-P与+P处理间的差异累积代谢物25个。属于有机酸的咖啡酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸在-P处理下的分泌量显著增加，且其中α-酮戊二酸对磷酸铝具有较强的溶解能力。此外，荧光定量PCR分析发现，柱花草根系中参与α-酮戊二酸合成的柠檬酸脱氢酶基因SgICDH在-P处理下的表达量显著增加。因此，柱花草根系通过上调SgICDH基因的表达，促进α-酮戊二酸的合成与分泌，从而增强对难溶性磷的活化利用，以适应缺磷胁迫。     

发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立

细茎柱花草(Stylosanthes gracilis)是圭亚那柱花草(S.guianensis)的野生近缘种，具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系，本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及4个发根农杆菌为供试菌种，探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明MSU440为诱导毛状根发生的最优菌株，诱导率为88.3%。其中，该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为菌液浓度OD600=0.3、侵染时间为15 min、共培养4 d,转化效率达34.72%。同时，获得的转基因材料通过聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分子鉴定方式，证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此，本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。     

柱花草SgALMT1基因克隆与表达分析

为探索铝激活苹果酸转运蛋白(Aluminum-activated malate transporter, ALMT)在植物适应酸性土壤铝毒害中的重要作用,本研究以柱花草(Stylosanthes guianensis)为研究材料,克隆了柱花草SgALMT1基因,并进行了生物信息学、亚细胞定位及基因表达分析。结果表明：SgALMT1基因全长为1 350 bp,编码450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6 kDa,包含6个跨膜结构域;亚细胞定位分析表明,SgALMT1蛋白定位在拟南芥原生质体细胞膜上,为膜蛋白。定量PCR结果表明,SgALMT1基因在柱花草叶中的表达量高于根中的表达量;铝处理增强了SgALMT1基因在柱花草根中的表达,表明SgALMT1基因可能参与了柱花草应对铝胁迫;另外,缺氮处理增强了SgALMT1基因在柱花草叶中的表达,而缺磷处理增强了SgALMT1在根中的表达。本研究结果为解析柱花草响应铝毒害和养分缺乏的机理提供了候选基因资源。     

柱花草磷高效种质筛选及根系形态对低磷胁迫的响应分析

为筛选磷高效柱花草(Stylosanthes guianensis)种质并解析其根系适应低磷胁迫的机理,本试验水培了31份柱花草,开展了磷效率评价,分析了低磷胁迫对柱花草根系的影响,并检测了6个扩展蛋白基因(Ex p ansins,EX P)响应低磷胁迫的表达模式.结果表明,低磷胁迫显著降低柱花草的干重和全磷含量.磷效...     

过量锰处理对苗期柱花草生长及抗氧化酶活性的影响

以2份柱花草基因型(TF210和TF226)为材料,分析过量锰处理对苗期柱花草生长、叶绿素浓度(SPAD)、最大光化学效率(Fv/Fm)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响,探究柱花草中潜在的耐锰机制。结果表明,过量锰(400μmol·L-1)处理显著抑制了柱花草基因型TF210地上部和根系的生长、降低了其叶片SPAD和Fv/Fm值,但对TF226生长影响不明显,说明TF226为耐锰基因型,而TF210为锰敏感基因型。虽然过量锰处理增加了两个柱花草基因型组织锰含量,但TF226地上部和根部的锰含量显著低于TF210,暗示在过量锰处理下,TF226积累了较少的组织锰含量。过量锰处理显著增加了两个基因型叶片SOD活性,但仅增加了TF226叶片POD和CAT活性,并且在过量锰处理下,TF226叶片SOD、POD和CAT活性值均高于TF210。以上结果说明维持根系生长、降低组织锰含量和提高抗氧化酶活性是苗期柱花草TF226耐锰的生理机制。研究结果为探索柱花草耐锰机理及耐锰柱花草品种改良提供了理论依据及种质材料。     

供磷水平对‘热研5号'柱花草-根瘤菌共生体系的影响

为研究不同供磷水平对热研5号柱花草(Stylosanthes guianensis‘Reyan No.5')-根瘤菌共生体系的影响,利用水培试验对接种7株不同根瘤菌的柱花草进行3个磷浓度的处理,通过对柱花草干重、植株含氮量、根瘤数、固氮酶活性的测定及分析确定磷对共生体系的影响。结果表明:低磷不利于柱花草及根瘤菌共生体系的生长;菌株YM11-1,FS3-1-1在高磷时固氮促生效果最佳,菌株LZ3 2,RJS9-2,BS1-1,CJ1则在中等磷条件下固氮促生效果最佳,磷对菌株PN13-3的影响不大。     

过量锰处理对苗期柱花草生长及抗氧化酶活性的影响

以2份柱花草基因型(TF210和TF226)为材料,分析过量锰处理对苗期柱花草生长、叶绿素浓度(SPAD)、最大光化学效率(F_v/F_m)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响,探究柱花草中潜在的耐锰机制。结果表明,过量锰(400 μmol·L^-1)处理显著抑制了柱花草基因型TF210地上部和根系的生长、降低了其叶片SPAD和F_v/F_m值,但对TF226生长影响不明显,说明TF226为耐锰基因型,而TF210为锰敏感基因型。虽然过量锰处理增加了两个柱花草基因型组织锰含量,但TF226地上部和根部的锰含量显著低于TF210,暗示在过量锰处理下,TF226积累了较少的组织锰含量。过量锰处理显著增加了两个基因型叶片SOD活性,但仅增加了TF226叶片POD和CAT活性,并且在过量锰处理下,TF226叶片SOD、POD和CAT活性值均高于TF210。以上结果说明维持根系生长、降低组织锰含量和提高抗氧化酶活性是苗期柱花草TF226耐锰的生理机制。研究结果为探索柱花草耐锰机理及耐锰柱花草品种改良提供了理论依据及种质材料。     

磷与海南柱花草生产

对热带地区柱花草生产的主要限制因子——磷进行了盆栽和田间试验研究，以探索柱花草的营养诊断适宜值和海南地区缺磷土壤的磷肥用量。试验表明，施用磷肥能提高产量、改善品质，随磷肥用量的增加，柱花草含磷量和粗蛋白含量提高；柱花草营养诊断的适宜磷含量为０．１４％～０．３４％，磷含量与采样时间无明显差异；根据磷肥试验建立的回归模型Ｙ＝５３２４．８５＋７４５．０５Ｘ－５０．５５Ｘ２，海南缺磷土壤推茬施磷（Ｐ２Ｏ５）量为：５２．５～９７．５ｋｇ／ｈｍ２（过磷酸钙３２９～６０９ｋｇ／ｈｍ２），最大施磷（Ｐ２Ｏ５）量应低于１１０ｋｇ／ｈｍ２。     

野生大麦对土壤磷吸收及其酸性磷酸酶活性的基因型差异

在土培盆栽条件下,以野生大麦磷高效基因型IS-22-30、IS-22-25和磷低效基因型IS-07-07为材料,研究施磷量为 0,30,60 和 90 mg/kg土条件下其磷素吸收能力及酸性磷酸酶活性变化的差异,为探明磷高效野生大麦高效吸收利用磷素机理提供依据。结果表明,1)随施磷量的增加,不同磷效率野生大麦生物量、磷积累量均有不同程度的增加,而根冠比呈显著降低的趋势,且不同施磷处理下,野生大麦生物量、磷积累量和根冠比均表现为磷高效基因型显著高于低效基因型。2)不同施磷处理下,野生大麦根际土壤有效磷和水溶性磷含量均显著低于非根际土壤。不施磷、施磷 30 和 60 mg/kg土条件下,磷高效基因型较低效基因型根际土壤有效磷和水溶性磷亏缺程度突出。3)与非根际土壤相比,在不施磷、施磷 30 mg/kg土条件下,磷高效基因型IS-22-30、IS-22-25根际土壤酸性磷酸酶活性的效应范围为4 mm,均明显大于低效基因型IS-07-07的活性效应范围2 mm。不同施磷处理下,磷高效基因型根际土壤酸性磷酸酶的活性明显高于低效基因型,且在不施磷、施磷 30 mg/kg土条件下差异显著,表明磷高效野生大麦具有较强的低磷土壤环境适应能力和土壤磷素活化能力。随施磷量的增加,不同磷效率野生大麦植株叶片和根系酸性磷酸酶的活性均显著降低,且高效基因型叶片和根系酸性磷酸酶的活性较低效基因型高,表明高效基因型植株体内磷素的重复再利用能力较强。低磷胁迫下,磷高效基因型较高的酸性磷酸酶活性是其磷素高效吸收利用的重要特征。     

低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250μmol·L-1 KH2PO4)和低磷(-P,5μmol·L-1KH2PO4)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。