白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇甲氧丙二酰ACP生物合成基因ozmF的遗传分析

恶唑霉素（oxazolomycin,OZM）是由白色链霉菌JA3453产生的杂合聚酮聚肽抗生素,其结构特征为螺旋链接的β-内酯/γ-内酰胺,垩唑环,（E,E）二烯和（Z,Z,E）三烯链。恶唑霉素具有抗肿瘤,抗病毒和一定的抗细菌的生物活性。前面工作中我们已经从白色链霉菌JA3453中定位了135kb的DNA区域,这个区域覆盖了整个ozm基因簇,对部分片段测序揭示了负责甲氧丙二酰ACP生物合成位点的6个基因。本文通过突变以及互补分析其中的甲基转移酶基因ozmF并证实其与恶唑霉素生物合成相关。这些结论有助于我们通过组合生物化学的方法产生新的OZM衍生物。     

白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇调节基因的中断研究

通过生物信息学分析,在白色链霉菌JA3453菌株的垩唑霉素生物合成基因簇中定位了2个调节基因。其中1个是属于LysR家族的调控因子编码基因ozmR,另1个为编码转录激活因子基因ozmU。为了研究这2个调节基因的功能,选用垩唑霉素的产生菌链霉菌JA3453为实验材料,采用目标PCR的方法,对调节基因ozmR和ozmU分别进行基因中断。HPLC-MS分析显示,ozrhR的中断可以提高垩唑霉素的产量,ozmU的中断则没有对垩唑霉素的产量带来明显影响。这些结论为利用调节基因提高垩唑霉素的产量提供了可能。     

波卓霉素生物合成基因簇的异源表达及产量提高

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11,通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中,对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵,通过提取纯化和HPLC-MS检测,表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素;试验并通过Red/ET重组系统,以红霉素启动子(ermE*P1)替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子,成功实现异源表达株M145/4E11波卓霉素的产量提高。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅱ型聚酮合酶基因sahA的功能分析

以酮基合酶基因KSa的简并性引物对Streptomyces sahachiroi基因组进行扩增,发现除了已知的阿嗪霉素B生物合成基因簇以外,还存在一个潜在的聚酮合酶(PKS)基因sahA.对sahA编码的氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,结果表明,sahA属于Ⅱ型聚酮合酶基因家族,与合成孢子色素的基因亲缘关系较近.通过单交换中断sahA基因后,链霉菌孢子的颜色由铅灰色变为白色,而产孢时间、孢子的产量以及其抗紫外线的能力都没有变化,对抗生素阿嗪霉素B的产量也没有影响.初步证实这个潜在的Ⅱ型聚酮合酶基因sahA很可能与S.sahachiroi孢子色素的生物合成有关.     

链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达

通过生物信息学分析,在链霉菌SH-62的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(ents),与已报道的来源于Streptomyces maritimus的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性。通过构建和筛选链霉菌SH-62的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,克隆得到完整的ents基因簇。将ents基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,HPLC和LC-MS分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了ents基因簇的生物学功能。     

全局调控基因对抗生素生物合成的影响

抗生素主要是由链霉菌发酵产生的,其生物合成受到严格和复杂的调控,全局调控就是其中重要的一类调控机制,在链霉菌中广泛存在,且作用方式多样、作用机制复杂。就近年来链霉菌中抗生素生物合成全局调控的研究进展进行综述,旨在对进一步阐明链霉菌次级代谢调控机制,并利用基因工程手段提高次级代谢产物产量及新型高产抗生素药物的研发有所裨益。     

金属离子对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响

【目的】研究不同金属离子对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响。【方法】用单因素摇瓶发酵试验方法,研究不同浓度Na+,Fe2+,Mg2+,K+,Ca2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+和Co2+对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响。【结果】在发酵培养基中添加Mg2+和Ca2+可促进褐黄孢链霉菌的菌体生长,添加Fe2+、Cu2+、Mn2+和Co2+可抑制菌体生长,而添加Na+、K+和Zn2+对菌体生长无显著影响;在发酵培养基中添加低浓度K+、Ca2+和Co2+可促进纳他霉素的生物合成,添加Na+、Fe2+、Cu2+和Zn2+抑制纳他霉素的生物合成,而添加Mg2+和Mn2+对纳他霉素的生物合成无显著影响。【结论】不同种类、不同浓度的金属离子,对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响差别较大;在培养基中添加适当浓度和种类的金属离子,有助于提高纳他霉素的产量。     

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。     

CoQ10生物合成限速酶及其编码基因对布菜凯特黑牛品种培育的实践意义

辅酶Q10（CoQ10）作为人体线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术研究及应用价值。由ubiA／coq2基因编码的对羟苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶是原核和真核生物CoQ生物合成途径的限速步骤,因此对该酶及其编码基因的研究显得尤为重要。对该酶及其编码基因的研究成果和现状进行综述和展望,旨在为布莱凯特黑牛品种培育的实践研究提供理论指导意义。     

不同菊芋花香气成分比较分析

菊芋花色鲜艳且部分基因型菊芋花香浓郁,具有较大的观赏价值。为了探讨不同基因型菊芋花香差异,本研究采用气相色谱三重四级杆质谱联用仪(GC-MS/MS)对JA204、JA230、QY1三种基因型菊芋花香成分进行检测,结果表明三种基因型菊芋花香成分均以烯类为主,其中花香较浓郁的JA204和JA230花朵含有较多的(3Z,6E)-α-法尼烯、金合欢烯,在花香较淡的QY1中未检测到,说明花香浓郁的菊芋花朵特征香气物质可能是(3Z,6E)-α-法尼烯、金合欢烯。本研究为菊芋花在生产和应用上提供了一定的理论参考依据。     

硫藤黄链霉菌基因组表达文库的构建及筛选

为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌株,同时通过PCR筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。TLC及HPLC-MS分析发现6个携带有aureothin生物合成基因簇的cosmid,通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素aureothin,证实文库异源表达及筛选的有效性。     

基于序列宏基因组学技术的芳香聚酮抗生素的发现

[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34 kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf 21)、链长因子基因(KSβ,orf 20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf 19)、环化酶基因(CYC,orf 17和orf 18)、糖基转移酶基因(orf 12)、单加氧酶基因(orf 16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF 21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF 20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420 nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447 nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。     

利用基因组发掘技术指导链霉菌SH-62中活性天然产物的分离及鉴定

通过生物信息学分析,利用基因组发掘技术发现链霉菌SH-62基因组中至少含有37个次级代谢产物的生物合成基因簇,除了有4个基因簇分别与已知的肠道菌素、潮霉素A、尼日利亚菌素和格尔德霉素的生物合成基因簇具有高度同源性以外,其他基因簇的功能鲜见报道。在不同发酵培养基上培养链霉菌SH-62,利用高分辨率的LC-MS对发酵产物进行分析,发现链霉菌SH-62确实能够产生肠道菌素、潮霉素A和尼日利亚菌素,从而证明了基因组发掘策略确实能够指导代谢产物的分离及鉴定。     

接合转移技术将外源DNA大片段引入变铅青链霉菌中的研究

为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。     

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4(6)的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶(PKS)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4(6)的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。     

低能离子注入诱变选育盐霉素高产菌株

[目的]研究N+离子注入对白色链霉菌的诱变效应,同时筛选高产盐霉素的变异菌株。[方法]利用不同剂量的氮离子对白色链霉菌S-11-04菌株进行诱变处理,研究低能氮离子注入对其存活率、菌落形状及产盐霉素能力的影响。[结果]低能氮离子注入对白色链霉菌的诱变效应显著,试验得到了13株盐霉素产量较高的突变菌株,其中N3-6菌株经连续传代4次,遗传稳定性较好,其摇瓶发酵水平较对照提高了41%,发酵生产后平均发酵水平提高了20.5%。[结论]离子注入诱变是获得高产盐霉素突变菌株的有效方法。     

多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制研究进展

多杀性巴氏杆菌可广泛感染多种动物,引起出血性败血症或传染性肺炎。多杀性巴氏杆菌的细胞表面具有一层黏液样的荚膜多糖,是其重要的结构成分和毒力因子,在细菌与宿主的相互作用中起到重要作用,促进细菌粘附于宿主表面,增强细菌的毒力。多杀性巴氏杆菌荚膜的分子结构与脊椎动物的糖胺聚糖（GAG）相似,都由重复的二糖单元聚合形成线性多糖链,这是该菌在感染宿主过程中进行分子伪装、抵抗吞噬和发生免疫逃逸的重要免疫学物质基础。近年来,在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成及其调控机制方面取得了一系列重要的研究进展,为多杀性巴氏杆菌荚膜的分子致病机理研究提供了一定的基础知识,为多杀性巴氏杆菌荚膜多糖疫苗的研发提供了理论依据。文章系统阐述了多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成途径及其表达调控机制,主要包括荚膜的血清分型、荚膜多糖的成分与结构、荚膜的生物合成基因簇与功能、荚膜多糖的分子合成机制、荚膜生物合成基因簇的表达调控机制,共5个方面。依据荚膜抗原,多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F共5种荚膜血清型。A型荚膜GAG成分是透明质酸、D型是肝素、F型是软骨素,分别由其相应的二糖单元[β-葡糖醛酸/β-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/α-乙酰葡糖胺]、[β-葡糖醛酸/β-乙酰半乳糖胺]重复构成;B型荚膜多糖是由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖以某种结构形式聚合而成,E型荚膜多糖的成分与化学结构尚不确定。多杀性巴氏杆菌A型、B型、D型、E型和F型荚膜多糖生物合成的相关基因以基因簇的形式存在,分为3个不同的功能区,R1、R2和R3;R1区负责转运荚膜多糖,R2区负责单糖的活化和荚膜多糖的组装,R3区负责荚膜多糖的修饰（磷脂替换）;根据R2区结构和基因数量的不同又可将5种荚膜的生物合成基因簇分为两类：A型、D型、F型为I类,R2区含有4个基因;B型和E型为II类,R2区含有9个基因,且利用R2区特异性基因设计引物,可以通过PCR方法快速鉴定多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型。多杀性巴氏杆菌的荚膜GAG在细胞质中生成,由R1区编码蛋白所形成的ABC转运体输出至细胞表面,末端糖脂通过分子间氢键与细胞壁紧密结合,形成菌体表面的粘液状荚膜;在多杀性巴氏杆菌荚膜GAG的生物合成过程中,位于R2区的糖基转移酶基因决定了活化单糖的种类和组装后荚膜多糖的类型。在多杀性巴氏杆菌荚膜的生物合成基因簇中,R1和R2区形成一个操纵子,转录方向一致,而R3转录方向与其相反,两者的启动子区域均位于R2和R3区域之间的DNA序列上;多杀性巴氏杆菌荚膜生物合成基因簇的转录过程受Fis蛋白正向调控,翻译过程主要受Hfq蛋白正向调节。     

玉米大斑病菌HST生物合成基因簇的结构和表达分析

【目的】分析玉米大斑病菌寄主选择性毒素（host selective toxin,HST）生物合成基因簇Cluster 397.3的结构,以及该基因簇组成基因在玉米大斑病菌侵染过程中的表达情况,为玉米大斑病菌HST的结构和功能研究奠定基础。【方法】以玉米大斑病菌23号生理小种et28a和01-23菌株,1号生理小种ny001和01-11菌株,玉米感病自交系B37为材料,利用antiSMASH技术预测玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇,通过Synteny共线性分析获得玉米大斑病菌HST生物合成基因簇Cluster 397.3,并对其基因组成和结构进行分析,再利用RNA-Seq技术分析该基因簇的组成基因在玉米大斑病菌侵染玉米叶片3,5,7,10 d的表达情况。【结果】玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇Cluster 397.3与交链链格孢（Alternaria alternata）ACT-毒素合成基因簇有保守的共线性,含有1个聚酮合酶（PKS）、1个氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）、1个短链脱氢酶/还原酶（SDR）、1个锌结合氧化还原酶（ZOR）、1个保守假定蛋白（CHP）、2个细胞色素P450（P450）及2个耐药转运蛋白（DRT）等9个基因。其中PKS与ACT-毒素合成酶基因ACTTS3同源,编码的聚酮合酶包括PksD、PS-DH、Methyltransf_12、PKS_KR、PKS_NbtC superfamily和NADB_Rossmann superfamily 6个典型结构域。RNA-Seq分析结果表明,将玉米大斑病菌接种玉米叶片3,5,7,10 d后,Cluster 397.3组成基因均能表达,且以3 d时表达量整体较高;除CHP基因外,01-11菌株中基因表达量均显著高于01-23菌株。【结论】Cluster 397.3基因表达差异与玉米大斑病菌生理小种的分化和致病特异性有关,该基因簇可能参与了玉米大斑病菌寄主选择性毒素的生物合成。     

香蕉果肉和果皮组织中乙烯生物合成的差异性反馈调节

Inaba等人对香蕉果实中乙烯生物合成反馈调节作用进行了研究,试图了解香蕉果实成熟前后,作为乙烯活性抑制剂的1-甲基环丙烯（1-MCP）的反向效应。在跃变前期香蕉果实里,1-MCP预处理完全阻止丙烯的诱导催熟作用,而在成熟初期的处理则刺激乙烯产生。对于跃变前期香蕉果实,较高浓度的丙烯对乙烯的产生有强烈地抑制作用,尽管早期丙烯有诱导乙烯产生的作用。     

玫瑰孢链霉菌SWU2010遗传转化体系的建立和优化

玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)是近几年备受关注的抗生素—达托霉素(Daptomycin)的产生菌, 具有重要的研究价值和应用前景.目的:为了对Streptomycesroseosporus中的功能基因进行研究,构建达托霉素 高产菌株,需要建立一种稳定、高效的遗传转化体系.方法:以 pSET152和 pKC1139为载体,探索优化了S.roseosporusSWU2010与大肠杆菌进行接合转移的条件,以此为基础将体外构建的ploxP质粒和带有cre重组酶基因 的质粒pALcre先后转入S.roseosporusSWU2010中.结果:AS-1培养基是接合转移的最佳培养基;孢子的预萌发 条件为50℃热激10min,转化效率达10-6~10-5.另外,抗生素覆盖时间16~18h效果最好.利用已建立的接合 转移体系,成功将两侧带有loxP位点的安普霉素抗性基因成功敲除.实验结果为进一步研究达托霉素的生物合成 基因和对达托霉素进行组合生物合成改造奠定了基础.