小麦TaCIPK2基因克隆及与TaCBLs蛋白互作分析

以普通六倍体小麦品种德抗961为材料,根据野大麦HbCIPK2的mRNA序列(GenBank序列号JN831652)设计引物,采用同源克隆方法从小麦中克隆TaCIPK2基因(GenBank序列号KU640381),测序结果显示该基因序列全长1421bp,开放阅读框(ORF)1359bp,编码452个氨基酸残基,预测分子量为50.91kD,pI为9.07。氨基酸序列比对结果表明:该基因与HvCIPK2(KP638475.1)、TaCIPK2(KJ561791.1)、HbCIPK2(JN831652.1)的相似度分别为94.69%、96.93%、95.80%,具有高度同源性;系统进化分析表明它们位于相同进化支上,亲缘关系最近。采用Real-timePCR方法分析不同逆境胁迫处理下TaCIPK2基因表达的特异性,200mmol/LNaCl高盐胁迫处理小麦幼苗后根和叶部TaCIPK2基因均上调表达;4℃低温胁迫处理后根部TaCIPK2基因上调表达,而叶部下调表达;100μmol/LABA胁迫处理后根和叶中TaCIPK2均上调表达。为检测TaCIPK2与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7的相互作用,构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK2,转化酵母Y187感受态细胞;同理pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7转化到酵母细胞Y2Hgold中,都没有出现自激活活性和毒性现象。共转化的二倍体酵母,只有pGADT7-TaCIPK2×pGBKT7-TaCBL2和pGBKT7-53×pGADT7-T在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培养基板上长出的菌落呈现蓝色,说明TaCIPK2能够与TaCBL2相互作用,激活下游报告基因HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2的表达,该研究结果对进一步研究TaCIPK2的功能有一定的指导意义。     

甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。     

拟南芥抗病相关基因T1N6-22互作蛋白的酵母双杂交鉴定

利用酵母双杂交技术,鉴定拟南芥抗病相关基因T1N6-22的互作蛋白,为进一步明确T1N6-22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。利用Gateway技术,构建T1N6-22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体AD-T1N6-22、AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480、BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480。将空载的AD载体分别与BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合共同转化酵母感受态细胞,检测各基因的自激活活性,发现T1N6-22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性,AT1G06050基因有自激活活性。将AD-T1N6-22载体分别与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合,BD-T1N6-22载体分别与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480载体组合,进行酵母双杂交试验。结果发现,AD-T1N6-22与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480,BD-T1N6-22与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480共转化的酵母细胞在二缺(-Leu/-Trp)、三缺(-Leu/-Trp/-His)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上均可以生长,表明T1N6-22与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480在酵母细胞中直接互作。     

林烟草中与蛋白激酶NsylCIPK24a互作的NsylCBL蛋白家族成员的筛选鉴定

植物CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,该家族成员通过与上游的CBL蛋白(Calcineurin B-like protein)互作,形成CBL-CIPK信号系统,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应过程。早期研究发现,拟南芥AtCIPK24分别通过与AtCBL4和AtCBL10互作,激活下游靶蛋白的活性,应对高盐胁迫。本研究前期从林烟草中获得了1个与拟南芥AtCIPK24同源的基因NsylCIPK24a,但与其互作的CBL家族成员及该激酶的具体功能尚不清楚。因此,本研究对林烟草CBL家族成员进行了全基因组预测;利用RT-PCR方法克隆CBL家族成员,并对其基因结构、蛋白保守结构域及组织表达情况进行了分析;通过酵母双杂交试验鉴定与NsylCIPK24a互作的林烟草CBL家族成员。结果表明,林烟草中共预测并克隆获得12个CBL家族成员;NsylCBL4、NsylCBL5、NsylCBL9和NsylCBL10 4个成员可与NsylCIPK24a在酵母中产生互作。推测烟草中可能也存在与拟南芥类似的应对盐胁迫的CBL-CIPK响应路径。本研究为解析林烟草NsylCIPK24a的功能、加深人们对烟草中CBL-CIPK调控通路的理解提供了研究数据。     

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建"诱饵"载体p GBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明"诱饵"载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将p GBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索Zj ERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。     

棉花GhMADS43基因的克隆及酵母自激活分析

为探索棉花GhMADS43基因在茎尖和花分生组织发育过程中的机理,从棉花中克隆了MADS-box家族中GhMADS43基因,并对该基因进行表达分析和酵母自激活分析,以期利用酵母双杂交筛选GhMADS43的互作蛋白质。对棉花中GhMADS43基因进行克隆及组织特异性表达分析,结果显示,GhMADS43基因全长696 bp,编码231个氨基酸,与其他植物中编码FUL蛋白的基因亲缘关系相近。由特异性表达分析可得,GhMADS43基因在根和顶芽中表达量较高;对2种不同果枝材料进行不同顶芽发育时期的表达分析表明,该基因在无限果枝材料中棉所50五叶期和六叶期的表达量显著高于一式果枝材料早铃1号。将该基因构建到酵母诱饵载体pGBKT7,得到pGBKT7-GhMADS43诱饵表达载体。重组质粒转化酵母Y2HGold菌株后,在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落变蓝。利用不同浓度的3-AT对其进行筛选发现,该基因不能在三缺培养基SD/-Trp/-His/-Ade中生长,表明该基因不具有自激活活性。构建好诱饵表达载体后,...     

酵母双杂诱饵表达载体pGBKT7-ufgt的构建与表达

构建葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L.cv Cabernet Sauvignon)花色苷合成前体酶——类黄酮葡萄糖基转移酶(UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase,Ufgt)诱饵表达载体。通过RT-PCR扩增获得葡萄ufgt基因CDS序列,与p GBKT7酵母诱饵载体连接;经测序和双酶切鉴定后,转化酵母菌株AH109,分析Ufgt蛋白在酵母菌株中的表达情况。成功扩增出ufgt基因CDS全长,并成功构建了p GBKT7-ufgt,重组载体p GBKT7-ufgt成功的转化到AH109酵母菌株中,且无毒和自激活性,能够正确稳定的表达。p GBKT7-ufgt酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续Ufgt蛋白互作筛选奠定基础。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因片段酵母双杂交诱饵载体

为探寻玉米淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIb)与其互作蛋白的作用位点,构建了酵母双杂交诱饵载体。根据CDD和NCBI对SBEIIb蛋白氨基酸序列的分析,确定玉米SBEIIb的功能域及非功能域,PCR扩增功能域及非功能域基因的目的片段,经回收纯化,用相同的限制性内切酶将其与载体pGBKT7进行双酶切后,分别将目的基因片段与载体pGBKT7进行连接。构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),转化酵母菌AH109的菌液,OD600值在0.8以上,证明诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X对酵母菌AH109没有毒性作用;转化诱饵载体后的酵母菌AH109,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,排除了pGBKT7-SBEIIb-X具有自激活宿主菌AH109的作用。构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7- SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),其表达对酵母细胞无毒性及对报告基因无自激活作用,可为下一步分析SBEIIb与其互作蛋白的作用位点奠定基础。     

HbTCTP及其截短体酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为进一步鉴定橡胶树翻译控制肿瘤蛋白(HbTCTP)与橡胶延伸因子1 (HbREF1)互作的分子区域,构建Hb TCTP及其截短体的诱饵载体。本研究利用RT-PCR技术从橡胶树胶乳中扩增出包含HbTCTP不同结构域的片段,克隆到p GBKT7表达载体,通过酶切、菌落PCR和测序鉴定后,转化酵母Y2HGold感受态细胞,检测诱饵蛋白是否具有自激活作用和毒性。结果显示,成功构建6个包含HbTCTP不同结构域的诱饵载体,且诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性和无自主激活报告基因的功能。本研究结果为进一步筛选HbTCTP与HbREF1互作的分子区域及阐明HbTCTP的功能提供科学依据。     

甘蓝BoExo70A1与BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测

Exo70A1是芸薹属作物柱头接受亲和花粉的必需因子,可能参与了干性柱头水分分泌和花粉水合过程。本文从自交不亲和甘蓝A1柱头c DNA中获取了Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因的编码序列,序列分析表明,Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因分别与At Exo70A1、At SEC3A、At SEC10、At SEC15B和At Exo84B基因的c DNA序列高度同源,其编码的5个蛋白均没有信号肽,Bo SEC3蛋白含有一个典型的EF-hand钙离子结合结构域。将Bo Exo84蛋白拆分为2个片段(Bo Exo84-N和Bo Exo84-C),并与Bo SEC3、Bo SEC10和Bo SEC15蛋白编码序列一起分别亚克隆至p GADT7质粒,Bo Exo70A1蛋白编码序列亚克隆至p GBKT7质粒,酵母双杂交检测结果表明,Bo Exo70A1蛋白能与Bo SEC3、Bo Exo84-N蛋白互作,但不能与Bo SEC10、Bo SEC15蛋白互作,这为深入探讨Bo Exo70A1蛋白乃至整个胞泌复合体在甘蓝干性柱头接受自花花粉排斥异花花粉过程中的作用机制提供了依据。     

槟榔黄叶病毒1外壳蛋白的互作蛋白筛选

为明确槟榔黄化病致病机理,探究槟榔黄叶病毒1 (areca palm leaf yellowing virus 1, APLYV 1)病毒与宿主蛋白之间相互作用的机制,本研究以槟榔叶片为材料,构建槟榔cDNA酵母双杂交文库,以APLYV 1的外壳蛋白(coat protein, CP)为诱饵,构建诱饵载体pGBKT7-CP,采用酵母双杂交技术,从槟榔cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果表明,成功构建槟榔酵母文库,文库容量达1.1×10⁷以上,重组率为100%,插入片段平均长度>1 000 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-CP,通过自激活实验检验,阳性对照在四缺培养基平板上能正常长菌且显蓝,阴性对照和实验组在二缺培养基平板上能正常长菌,在三缺和四缺培养基平板上未长菌,表示构建成功的重组诱饵载体无自激活活性,可用于筛库实验。共筛选出13个阳性克隆,经NCBI网站与槟榔转录组库进行比对,最终得到10个候选槟榔蛋白,包含sHSP (small Heat Shock Protein)与DnaJ蛋白等。选择DnaJ蛋白,通过理化性质分析和蛋白二级结构预测,发现该槟...     

利用酵母双杂交系统筛选春兰开花调控蛋白DEF3的互作蛋白

为了探究春兰DEF3蛋白与其它花发育蛋白之间的相互作用,本研究以春兰为实验材料,克隆了18种花发育相关基因:AP1-2、AP1-3、AP2-1、AP2-2、AG1、AG2、AG3、DEF1、DEF2、DEF3、DEF4、GLO、SEP1、SEP2、SEP3、SEP4、AGL6-1、AGL6-3。利用酵母双杂交体系,构建了诱饵质粒p GBKT7-DEF3及18种猎物质粒,并通过实验验证诱饵质粒没有自激活现象。进行酵母双杂交实验,最终获得六个蛋白与DEF3互作,分别是:AP1-2、GLO、AG1、SEP2、SEP4、AGL6-3。     

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。     

小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD6000.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。     

2种环境下水稻灌浆期穗长的动态遗传研究

为了探知水稻穗长的动态遗传机制,利用由穗型差异大的水稻品种Milyang 46和FJCD建立的包含130个株系的F10重组自交系,测定福建武夷山和莆田环境下穗长灌浆期的动态变化值,并进行了QTL定位及其互作研究。结果检测到35个加性QTL,16个加性×环境互作QTL,1对加加上位性效应。QTL定位分析检测到的35个加性QTL,位于1、2、4、5、7、8、9、10、11号染色体上,对表型变异贡献率0.5%~16.52%。环境互作分析检测到的16个GE互作位点,分布在水稻1、2、3、4、5、7、8、9、11号染色体上,大部分为微效QTL。武夷山环境中,还检出1对加加上位性QTL,对表型变异贡献率达到33.14%。此研究一定程度上揭示了穗长遗传机制,为水稻育种提供了依据。     

玉米ZmCIPK24-2基因在盐胁迫应答中的功能研究

土壤盐化会影响作物正常生长发育,导致农作物减产。植物在长期适应环境的过程中,进化出了相应的耐盐分子机制。钙调磷酸酶B类蛋白(CBL)及CBL互作蛋白激酶(CIPK)参与植物对盐胁迫的响应。本研究鉴定到一个拟南芥AtSOS2的同源基因ZmCIPK24-2,实时荧光定量聚合酶链式反应结果表明ZmCIPK24-2基因在玉米各组织部位广泛表达,其中在花粉表达量最高;ZmCIPK24-2受盐胁迫诱导表达。ZmCIPK24-2能部分互补拟南芥atsos2突变体的盐敏感表型,在高盐浓度下转基因株系比atsos2突变体的存活率显著提高,根长显著增长。亚细胞定位实验表明ZmCIPK24-2定位于细胞质、细胞膜与核膜。利用酵母双杂交实验及LUC互补成像实验发现ZmCIPK24-2与玉米CBLs家族中的ZmCBL1、ZmCBL4、ZmCBL8和ZmCBL9互作。本研究为解析玉米CBL-CIPK信号通路的功能提供了新的实验证据。     

水稻幼苗对多浓度Fe2+胁迫的QTL联合检测

用珍汕97B/密阳46的RIL作图群体,以基本营养液培养为对照(CK),设2种Fe2 (160 mg/L和240 mg/L)作为胁迫处理,以处理20 d的幼苗相对苗高(%)(处理苗高/对照苗高×100%)作为幼苗耐Fe2 胁迫程度的评价指标,进行2个环境的QTL联合检测分析.结果表明,RIL群体株系间对Fe2 胁迫反应差异较大,明显出现超亲分离.共检测到4个耐Fe2 胁迫的主效QTL,即qTFS-1-1、qTFS-3、qTFS-6和qTFS-9,分别位于第1、3、6和9染色体上,可解释14.96%的表型变异,它们与Fe2 胁迫浓度并无显著的G×E互作,表明这4个耐性基因在不同浓度Fe2 胁迫处理下,均可稳定表达.试验还检测到3对耐Fe2 胁迫的加性×加性上位性互作,共可解释7.16%的表型变异,涉及第1、2、7、9、12等5条染色体,该3对上位性互作与Fe2 不同浓度胁迫处理也无显著G×E互作.     

谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析

CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出7个候选CBL基因,命名为SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守,所有预测SiCBL基因都含有7~8个内含子,而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测SiCBL基因均含有4个EF-Hand功能域而且相邻EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在,所有CBL基因被分为4个亚组。7个候选SiCBL基因中, 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达,3个(SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7)受高盐胁迫诱导表达。SiCBL3基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子CBL基因丰富和完善了植物CBL成员, 为进一步研究CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。     

植物CBL-CIPK信号通路响应非生物胁迫作用机制的研究进展

环境胁迫是阻止植物生长和发育的关键性因素。类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBLs与其互作蛋白激酶CIPKs组成的CBL-CIPK信号系统是一种基本的钙感受器,在感知不利的环境条件时起到重要的作用。近几年,CBL-CIPK复合体的研究主要集中于逆境条件下其如何调控下游靶点,例如:离子通道和转运蛋白。文章主要对CBL和CIPK家族的结构特征、CBL-CIPK复合体抵御环境胁迫和植物激素应答的研究进展进行了综述,并对未来CBL-CIPK信号系统研究的重要方向做出了展望。     

利用Bayes分层广义线性模型剖析大豆籽粒性状的遗传基础

以溧水中子黄豆(P₁)和南农493-1(P₂)组合的504个正反交F_2:3~F_2:7家系群体为材料, 调查大豆粒长、粒宽、粒厚、长宽比、长厚比、宽厚比和百粒重性状在2007—2011年的表型观测值, 扫描F₂群体SSR分子标记信息, 用Bayes分层广义线性模型方法检测了上述性状的主效QTL、QTL´环境(QE)互作、QTL´细胞质(QC)互作和QTL´QTL(QQ)互作。共检测到89个主效QTL、33对QE、20对QC和35对QQ互作。上述7个性状的主效QTL分别有7、10、10、19、19、17和7个; QQ互作分别有1、10、6、0、6、9和3对, 没有检测到显性´显性互作; QE互作分别有5、7、6、3、6、2和4对; QC互作分别有2、1、3、8、4、2和0对。主效、QQ互作、QC互作和QE互作QTL的总贡献率分别为12.42%~61.79%、0~23.21%、0.35%~1.51%和0~14.16%, 表明主效QTL贡献最大, QQ互作次之, QE互作最小。各类QTL都有一因多效现象, 同一基因座可通过不同方式影响性状表达。这些结果揭示了大豆粒形性状的遗传基础, 为标记辅助育种提供了参考信息。