南方型紫花苜蓿耐盐突变体叶片盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用。以南方型紫花苜蓿Medicago sativa‘Millennium’的耐盐突变体为材料,以正常培养(MT_CK2)和盐胁迫(MT_N2)条件下的2个样品叶片进行转录组测序分析,并进行qRT-PCR验证RNA-Seq结果的可靠性,研究耐盐突变体叶片盐胁迫应答相关转录因子基因。结果表明:经过250 mmol/L NaCl胁迫72 h,共检测到30 900个基因表达量发生了变化,7 694个基因差异表达,共有隶属于50个转录家族的422个转录因子发生了差异表达,上调表达268个,下调表达154个。盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是WRKY、NAC、b HLH和AP2-EREBP转录家族。此外,候选出MsANT、Msb HLH36、MsNAI1、Msb ZIP、Msb ZIP73A、MsC3H、MsMYB85、MsNAD、MsMYB、MsNAC、MsTrihelix和MsWRKY等与盐胁迫应答相关的重要转录因子。本研究为揭示紫花苜蓿盐胁迫分子机制奠定基础。     

陆地棉耐盐相关EST-SSR以及EST-InDel分子标记的开发

随着棉花基因组学、转录组学等重要学科的快速发展,针对候选基因进行序列多样性分析,开发基于候选基因的分子标记,将能够极大推进棉花分子育种研究。本研究利用高通量的测序技术对耐盐陆地棉品种Miscott 7913-83和盐敏感品种苏棉12盐胁迫前后根、叶总RNA的混样进行了转录组测序,对不同盐处理时期Miscott 7913-83和苏12根和叶分别进行表达谱分析。获得3232条盐胁迫下差异表达基因;基于差异表达基因利用生物信息学手段大规模开发了SSR以及In Del等分子标记;随机选择了部分SSR及In Del引物进行验证,进一步证实了分子标记的准确性。本研究为快速开发陆地棉品种间多态性分子标记提供了高效可行的分析方法,通过开发陆地棉耐盐相关功能标记,以期用于分子标记辅助育种改良陆地棉耐盐性。     

小麦bZIP家族转录因子的鉴定及其在盐胁迫条件下的表达分析

b ZIP (Basic region/leucine zipper motif)蛋白是真核生物中普遍存在的一类转录因子,对植物应答胁迫具有重要作用。为了鉴定bZIP家族转录因子基因是否参与小麦盐胁迫响应的调控过程,获得更多与盐胁迫相关的b ZIP转录因子,本研究以‘科农199’(KN199)为实验材料,利用Illumina HiSeq平台进行150 bp双端测序,从转录组水平检测了bZIP家族转录因子基因在小麦盐胁迫条件下的差异表达情况。结果显示,每个处理的生物学重复之间的相关系数都在0.97以上,说明本实验中样品重复性较好,在处理不同时间点样品间的差异非常显著。根据中国春(Chinese spring, CS)参考基因组筛选到的156个小麦bZIP家族转录因子中,有14个bZIP转录因子位于5B染色体上;经盐处理1 h后,鉴定出14 544个差异表达基因(DEGs),包括49个b ZIP转录因子基因;在处理6 h后,鉴定出25 546个DEGs,包括59个bZIP转录因子基因,并且b ZIP转录因子基因在两组样品之间有35个共同的DEGs,其中有25个基因上调表达,10个基因下调表达。小麦响应盐胁迫b ZIP转录因子基因进行聚类分析结果与基因表达差异的结果一致。研究发现不论是总的DEGs还是差异表达的bZIP转录因子基因的数目,均随着处理时间的延长而增加,推测这些基因可能参与调控小麦盐胁迫反应。     

盐胁迫条件下耐盐番茄叶片差异蛋白表达分析

以导入红海榄总DNA的耐盐番茄及其野生型番茄为材料,于3~4片真叶期分别用调和海水(约1%盐度)和自来水进行灌溉,处理14 d后,采用BPP法提取番茄叶片的全蛋白质,通过等电聚焦和第二向SDSPAGE电泳得到清晰的番茄叶片全蛋白质双向电泳图谱。利用Image Master 2D platinum 6.0软件对海水处理及对照条件下耐盐番茄及野生型番茄差异表达的蛋白进行分析发现,蛋白质双向电泳图谱大约有800个蛋白点,共检测到123个差异蛋白点,每张图谱的匹配率达90%。海水处理下的耐盐番茄与野生型番茄的叶片全蛋白质图谱中共检测到82个高丰度的差异蛋白点,其中42个蛋白点的表达量为上调,40个蛋白点的表达量为下调。对差异表达的蛋白质点进行了基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定,得到了相关的差异蛋白质信息,为揭示耐盐番茄的耐盐机理、为克隆相关耐盐基因提供了帮助。     

重金属Cd胁迫和添加Si后番茄根的转录组初步分析

为探究重金属镉(Cd)胁迫和添加硅(Si)后对番茄根基因表达变化特性,以期为番茄低吸收Cd育种和Si抑制Cd吸收提供基因资源和理论基础。以‘耐裂王’番茄为材料,设置3个处理组:未添加Cd和Si的对照(CK)处理,添加Cd处理,添加Cd一周之后添加2 mmol/L的Si处理。本研究测定了番茄植株生物量和番茄根中镉含量,利用Illumina HiSeq高通量测序法对番茄根进行转录组测序,对转录组进行GO分类和KEGG通路富集分析。结果表明:Cd可以抑制番茄植株的生长,添加Si后可以抑制根中Cd的积累。以上3个处理相互比较分别有1 054、1 061和204个基因显示了表达差异;对比CK来看,表达差异基因主要富集在细胞壁、氧化还原酶活性及有机酸运输等功能。Cd+Si处理组对比Cd处理组,表达差异基因主要富集在细胞壁、氧化还原酶活性及有机酸运输等功能;番茄根受到Cd胁迫的时候主要以上调基因表达的模式来应答胁迫,加入Si以后,虽然番茄根还是以上调基因表达为主,但有所降低,相比只有Cd的处理组,上调基因下降了11.1%。通过KEGG通路富集分析,发现Solyc07g061720.3 (GA2ox4)、Solyc06g082590.1 (SlCRF1)和Solyc12g009220.2 (SlJAZ2) 3个基因表达上调可能与Cd抑制番茄生长有密切关系;番茄根中脂类代谢相关基因的差异表达与Si抑制Cd吸收有密切关系;Solyc05g051200.1 (ERF1)表达上调与添加Si增强番茄抗性有关。本研究有助于认识Cd和Si对番茄生长和Cd富集在基因层面的影响,并且对今后重金属污染防治工作有一定的指导意义。     

花生MAPK基因的筛选和盐胁迫分析

促有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长发育及抗逆胁迫过程中发挥重要作用。为了解花生中MAPK基因的情况,利用RNA测序技术对花生耐盐突变体(S2)和对照(S4)进行了转录组分析,筛选出了14个MAPK基因,位于花生野生种基因组A组的6条染色体上。聚类分析表明,花生14个MAPK基因中13个可以聚到已报道的4个亚类中。利用花生S2和S4构建了盐胁迫处理前后的表达谱,根据调整后的P值,筛选出6个MAPK基因在S2和(或)S4受盐胁迫诱导表达,分别属于A(1个)和D亚类(5个)。为花生MAPK基因的功能验证和利用奠定了基础。     

细胞工程技术培育玉米耐盐自交系

以山东省玉米骨干自交系齐319、鲁原341、Lx9801、8112的幼胚为外植体，在含有浓度梯度NaCl（2g／L，5g／L，10g／L）的培养基上筛选，获得了耐盐愈伤组织；分化出的幼苗，自交结实。下一代通过水培、沙培、盐碱地种植进行耐盐性测定，选择耐盐植株，对后代继续进行耐盐性鉴定、筛选，获得了耐盐突变体，为玉米抗逆育种提供新的种质资源。     

玉米发芽期响应盐胁迫的转录组分析

玉米种子发芽期对盐分较为敏感,为了进一步明确玉米发芽期对盐胁迫的应答机制,本研究利用高通量转录组测序技术,对玉米耐盐自交系昌7-2在150 mmol/L NaCl胁迫下的胚芽进行转录组测序和数据分析。结果表明：共有40 290个Unigenes获得功能注释,其中差异表达基因615个。在差异表达基因的GO富集分析中,对富集程度明显的前20个类别做出功能分析。有21个DEGs富集到苯丙烷类的生物合成途径,是KEGG富集分析最显著的通路。对差异表达基因进行COG分类,共得到25个不同的COG功能注释。通过对目标基因的挖掘共得到13个较重要的转录因子,涉及到MYB、WRKY、AP2、bZIP、bHLH和NAC等6个家族。本研究为挖掘玉米耐盐相关基因、解析玉米响应盐胁迫的分子调控机制提供科学依据。     

盐胁迫下不同甘薯品种的转录组测序分析

为了获得甘薯耐盐转录组序列信息,挖掘差异表达基因及其相关代谢途径,本文以盐胁迫处理0 d、3 d和6d的耐盐甘薯品种‘榕薯819’以及不耐盐甘薯品种‘榕薯910’的叶片为材料,借助高通量测序技术进行转录组测序分析。结果表明, 2个品种共获得157,252条Unigenes,平均组装长度为576 bp。其中有83,264条Unigenes在七大数据库中得到注释,占总数的52.95%。NR注释分类结果显示,在牵牛花(Ipomoea nil)中比对到同源序列的Unigenes最多,共43,620条,占总数的57.05%。Unigenes在KOG数据库中的注释主要富集在普通功能预测(8752个)、信号转导机制(5067个)以及翻译后修饰、蛋白转换、分子伴侣(4471个)中。差异表达分析显示,在‘榕薯819’中,盐处理3 d和6d的样品差异表达基因数分别为323个和3752个,共参与了33个GO功能分类项和302条KEGG代谢通路。在‘榕薯910’中,差异表达基因数则分别为5554个和7395个,共参与了50个GO功能分类项,涉及了329条KEGG代谢通路。以部分差异表达基因的转录组数据为基础,...     

棉花盐胁迫下叶片miRNAs的鉴定与分析

microRNAs(miRNAs)是一类21~24个核酸长度的非编码小分子RNA(sRNA,small RNA),通过介导目标mRNA的切割或者抑制翻译来调节植物基因的表达。本文利用200 mmol·L-1NaCl分别处理3叶期耐盐品系早熟长绒7号和盐敏感品系南丹巴地大花4 h,构建了4个小RNA文库并测序。以雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii L.)D5基因组和本实验室陆地棉(Gossypium hirsutum L.)盐胁迫转录组测序拼接得到的序列作为参考,共发现360个miRNA,包括308个保守的miRNA和52个可信度高的新miRNA。2个品系共出现94个差异表达的miRNA,表达模式可分为2大类,筛选出20个候选miRNA。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析表明,耐盐品系显著富集的信号通路是抗原加工过程,而盐敏感品系显著富集的是生物碱合成途径。     

基于组学技术探究甜菜耐盐机理研究进展

为揭示甜菜盐胁迫下的分子响应机制,利用组学技术发现并鉴定关键基因及蛋白,迅速给予甜菜耐盐机理新的依据。本研究综述了转录组学、蛋白质组学、代谢组学、基因组学在甜菜耐盐机理中的研究进展。目前研究指出转录组学、蛋白质组学可筛选出甜菜耐盐关键候选基因,如BvM14-SAMS2、BvM14-glyoxalase I、BvNHX等,并利用基因组学对所发现基因进行验证。同时,探讨代谢组学在甜菜盐胁迫研究中的应用,以期通过代谢产物的定量与定性测量评估基因功能,为甜菜盐胁迫相关研究提供新信息与新思路。下一步应不断深化各组学技术间的融合,强化多学科交叉融合意识并积极创新,以发掘更多优质的甜菜耐盐遗传种质资源与基因资源。     

基于高通量测序的露地菊(Chysanthemum×grandiflora)盐胁迫转录组分析

为揭示露地菊生长发育及耐盐胁迫的应答机制和分子基础,本研究以盐胁迫处理的露地菊及其对照为材料,使用Illumina Hiseq2500高通量测序平台对转录组进行测序,分别获得了60370448和71415448条Clean reads,通过序列拼接组装得到45591条Unigene,平均长度724 bp。有37675条Unigene在七大数据库(COG,GO,KEGG,KOG,Pfam,Swiss-Prot,NR)中得到注释。通过比对露地菊盐胁迫处理组和对照组样品间Unigene的表达量及在各数据库中的注释情况,统计得到:有4143条差异表达基因获得注释;有2441条差异表达基因在GO数据库中获得功能注释;注释到COG数据库中的2281条差异表达基因依据功能可分为25类;有1062条差异基因映射到KEGGPathway数据库中,涉及了199个代谢通路,包括核糖体途径、植物激素信号传导途径、淀粉蔗糖代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成等。本研究获得的转录组数据将有助于揭示露地菊生长发育及耐盐胁迫的应答机制和分子基础,及相关抗性基因的挖掘和分子辅助育种等方面的研究。     

拟南芥SB10基因在耐盐中的功能研究

为了研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术构建载体敲除SB10基因,对转基因植株进行筛选成功获得SB10基因沉默的突变体材料。本研究通过观察突变体根长及萌发率等表型,测定突变体植株脯氨酸含量相关的抗逆生理指标,研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能。结果显示:NaCl胁迫下,sb10突变体的根长和萌发率明显高于野生型拟南芥,sb10突变体拟南芥植物体内脯氨酸含量明显高于野生型拟南芥。说明SB10基因功能的缺失可提高拟南芥植株的耐盐能力。该研究为SB10基因参与拟南芥植株耐盐中的分子作用途径及分析提供线索。     

番茄耐盐分子育种研究进展

土壤盐渍化是一个世界性问题,其中由于过量施用化肥,造成土壤尤其是蔬菜保护地次生盐渍化已是一个极其严重的现象,常障碍蔬菜作物的生长、发育,导致大幅度减产,产品品质下降。虽然作物耐盐新品种的选育,一直是国内外研究的重点,但对于番茄而言,普通栽培种一般表现对盐中度敏感。目前还尚未有很明确的生理生化指标,可供育种者直接进行番茄耐盐性的鉴定,番茄耐盐机理的明确,有助于相关指标的获得。研究业已表明,番茄耐盐受QTLs控制,遗传较为复杂,影响番茄耐盐的QTL在不同生长发育的阶段也不相同。因此育种难度较大。番茄在芽期和苗期对盐害最敏感,随着株龄的增加,耐盐性也增强,而影响番茄芽期和苗期的耐盐性为少数QTLs控制,且效应较大,因此开发芽期和苗期耐盐QTLs对于番茄耐盐育种意义较大。另外,耐盐QTLs还包括组成型和非组成型两种,控制番茄耐盐的组成型或非特异QTL对耐盐性贡献较大。部分野生资源材料及个别栽培种表现出一定程度的耐盐性,为番茄耐盐育种提供了可能。利用分子标记及生物工程技术深入挖掘这些材料,可加速番茄耐盐遗传改良。本文就番茄耐盐筛选方法、耐盐资源材料,耐盐QTL定位及利用分子标记辅助选育和基因工程等手段改良番茄耐盐新品种进行了综述。     

TILLING技术在水稻耐盐基因SKC1突变体筛选中的应用

TILLING技术是一种高效检测SNP的反向遗传学方法。根据已克隆的水稻耐盐主效基因SKC1设计特异引物,以化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)处理获得的1310份M2代水稻为材料,利用TILLING技术检测突变位点。经过2011~2012年2年M2、M3代的连续检测及测序分析,获得SKC1基因纯合突变体5份,杂合突变体14份,研究结果表明利用TILLING技术进行水稻耐盐突变体筛选是非常有效的。     

利用转录组测序分析茄子萼片刺相关差异基因

为了发掘茄子萼片刺形成的相关基因,为茄子萼片刺形成的机理和基因定位奠定基础,以萼片有刺和萼片无刺的2个自交系1607和1608为材料,构建了F2遗传分离群体,利用新一代高通量测序手段对双亲和2个混池的转录组进行了测序分析。通过转录组分析,共获得409 363 358个干净的高通量序列,其中比对到参考基因组的序列共有311 756 616个,比对效率均大于75. 00%。发掘24 310个新基因,其中获得注释信息的新基因总数为1 540个。对转录组测序获得的全部基因表达量进行了分析,在双亲中共得到2 438个差异表达基因,其中97个差异基因在2个混池中同时存在。通过对差异基因的注释分析,富集到了可能与茄子萼片刺形成的相关的候选基因3个:Sm CKX(Eggplant_newGene_1802)、Sm STS(Sme2. 5_09750. 1_g00002)和Sm FAR(Eggplant_newGene_4241)。Sm CKX是一个茄子细胞分裂素氧化酶/脱氢酶相关基因,与番茄的Solyc04g080820. 2和Solyc04g080810. 3,拟南芥的At CKX6具有同源性。Sm STS是茄子水苏糖合成酶相关的基因,与番茄的Solyc01g079300. 3基因和拟南芥的AT4G01970. 1基因同源性较高。Sm FAR是一个脂肪酰辅酶A还原酶相关基因,与番茄Solyc11g067180. 2基因(FARx相关基因)同源。以上同源基因参与了植物角质,小檗碱和蜡生物合成途径、细胞分裂素合成途径和水苏糖代谢途径,因此,茄子萼片刺的形成可能具有相同的代谢调控途径。     

黄瓜耐冷相关基因的表达分析

低温胁迫是影响黄瓜正常生长的主要障碍因子之一,其耐冷性强弱直接影响黄瓜产量。关于黄瓜耐冷性的鉴定及耐冷机制已有较多研究,鲜有耐冷基因的报道。为挖掘黄瓜耐冷基因,提高其耐冷性,本研究根据拟南芥及其他作物中已报道的耐冷基因并结合相关转录组信息,筛选出12个耐冷相关基因。并利用5份不同耐冷级别的黄瓜材料,对12个耐冷相关基因进行表达分析,进一步确定5个差异表达基因,明确5个基因在低温胁迫中的表达模式,为下一步对其进行功能研究奠定了基础。     

水稻耐盐基因SKC1特异性CAPS标记的开发与验证

SKC1基因是已经成功克隆的水稻耐盐主效基因,位于水稻1号染色体。为在水稻育种中快速与高效利用SKC1耐盐基因,本研究利用经过TILLING技术检测得到的SKC1基因的SNP突变体为材料,分析突变位点的限制性酶切位点,筛选到特异性的内切酶Msc I,通过酶切PCR产物、琼脂糖电泳、酶切片段分析,开发建立了SKC1突变位点的CAPS标记,命名为CAPS/Msc I。并利用该标记对40份突变群体进行了纯合、杂合和野生型酶切分型,筛选出纯合突变体5份,并对选择结果进行了测序验证。结果表明该CAPS标记准确可靠,可用于耐盐分子标记辅助选择育种。     

陆地棉幼苗NaCl胁迫下转录因子的转录组学分析

以棉花耐盐种质早熟长绒7号和感盐种质南丹巴地大花为材料,利用转录组测序(RNA-Seq)技术分析2个种质在200 mmol L–1 Na Cl胁迫4 h和24 h后幼苗叶片的转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,从样本中鉴定出54个转录因子家族的2815个转录因子。盐胁迫4 h后,长绒7号有249个转录因子基因表达发生变化;南丹巴地大花中有261个转录因子基因表达发生变化。在胁迫24 h后,2个种质对盐响应的转录因子数量均剧增。只在耐盐种质长绒7号特异表达的有106个(4 h)和184个(24 h)转录因子基因,对于2个种质共同表达的转录因子有143个(4 h)和282个(24 h)。通过筛选,鉴定出26个与耐盐相关的转录因子家族124个转录因子基因,并采用荧光定量验证转录组数据的准确性。推测高表达的11个转录因子的基因CotAD_66280(HD-ZIP)、CotAD_47058(ERF)、CotAD_18472(G2-like)、CotAD_04289(C2H2)、CotAD_57763(HSF)、CotAD_23656(TCP)、CotAD_02221(ERF)、CotAD_23975(WRKY)、CotAD_54036(MYB)、CotAD_27788(NAC)和CotAD_23815(HSF)有可能与陆地棉抗盐性密切相关,可作为陆地棉耐盐育种的候选基因源。     

用花药培养筛选耐盐变异体培育小麦耐盐品种的新途径

１９８６－１９９１年，应用花药培养与耐盐变异体筛选相结合的方法，对小麦耐盐育种新途径进行了探索，研究结果表明，在小麦花药培养中，选择加入一定浓度的ＮａＣｌ的筛选培养基，可以筛选出耐盐变异体，获得耐盐花培株系，经５个有性世代的鉴定表明，耐盐变异体的耐盐特性可以稳定遗传给后代，经筛选的花培株系中，耐盐特性能够稳定遗传的株系比例约占１／４，应用于育种实践，经多点鉴定，选育出了一批有实用价值的种质材料和优