本生烟脂质转移蛋白基因克隆及VIGS沉默载体和过量表达载体构建

非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。     

杧果MiPAO基因的克隆表达分析及其基因沉默载体的构建

为了探究杧果PAO基因在杧果果皮叶绿素降解中的作用,利用转录组测序得到PAO部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,选取了红色贵妃、黄色金煌、绿色桂七等3个不同着色杧果品种为试验材料,分别克隆得到了杧果果皮PAO基因的全长c DNA序列,生物信息学分析后将其命名为MiPAO。结果表明,3个着色品种c DNA序列只有几个碱基的差异,以红色贵妃品种为例,经过分析可得全长c DNA序列的大小为1 979 bp,开放阅读框大小为1 641 bp,总共编码546个氨基酸,其分子质量为61. 82 ku,等电点为6. 54。通过生物软件预测得到了MiPAO蛋白的二级结构和3种三级结构图,同时发现MiPAO蛋白为亲水性蛋白。对NCBI上登录的部分植物的PAO蛋白构建系统发育树发现MiPAO蛋白与橙子的亲缘关系近。成功构建出p TRV2-MiPAO基因沉默载体,希望能为后续研究杧果果皮着色的分子机理和桂七杧果的滞绿原因提供一定的试验支持。     

荔枝多胺氧化酶(PAO)基因家族的全基因组鉴定与表达分析

为了探究PAO基因在荔枝(Litchi chinensis Sonn.)生长发育过程中的生物学功能,本研究基于荔枝全基因组数据,利用生物信息学方法筛选与鉴定荔枝PAO基因(LcPAO)成员,并对其理化性质、系统发育、结构、染色体定位、顺式作用元件、蛋白结构、miRNA靶位点和表达模式进行了分析。结果表明,一共鉴定得到10个LcPAO基因,全部为亲水蛋白。系统发育分析发现LcPAO落在4个亚族中的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚族。LcPAO1～LcPAO3和LcPAO9～LcPAO10属于典型的PAO蛋白,LcPAO4～LcPAO8还含有一个特异的SWIRM结构域,属于非典型PAO蛋白。顺式作用元件分析表明其主要含光响应元件、逆境胁迫相关元件以及激素响应相关元件。miRNA靶位点分析发现LcPAO基因受到22个miRNAs的靶向调控。转录组表达模式分析发现,除了LcPAO1和LcPAO4,余下的LcPAO基因可能与荔枝果皮着色相关。所有的LcPAO基因均可能与荔枝的化学控花相关。除了LcPAO1所有的LcPAO基因均可能与荔枝果实脱落相关。本研究为深入研究LcPAO基因的功能和调控机制提供参考。     

芒果(Mangifera indica)RCCR基因的克隆及其基因沉默载体的构建

红色叶绿素降解产物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase,RCCR)是叶绿素降解过程的关键酶,能将叶绿素降解过程中产生的红色叶绿素代谢物(Red chl catabolit)分解代谢为原初荧光叶绿素降解产物(Primary fluorescent chl catabolite)。本研究根据转录组测序得到RCCR部分片段信息设计简并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行RCCR基因全长cDNA序列的扩增克隆得到了芒果果皮RCCR基因的全长cDNA序列。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以黄色金煌品种为例分析可得全长cDNA序列为1 134 bp,开放阅读框为975 bp,编码324个氨基酸,分子重量为36.21 k D,等电点为5.13。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与橙子、克莱门柚等水果植物的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。近年来,病毒诱导的基因沉默(VIGS)是研究植物基因功能的有力工具,为深入探究RCCR基因在叶绿素降解中的作用,本研究成功构建出RCCR-pTRV2基因沉默载体,为后续研究RCCR基因在芒果果实成熟及果皮着色过程中的作用机理提供理论依据。     

森林草莓FvSPL2基因克隆、过表达载体构建及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子是植物特有的一类基因家族,广泛存在于高等植物中,在植物营养生长和生殖发育中起着重要的调控作用。为了探究SPL基因对森林草莓(Fragaria vesca)花发育的影响,本研究以森林草莓‘Hawaii4’为试验材料,基于森林草莓转录组数据分析,克隆得到SPL转录因子基因FvSPL2,对其进行生物信息学和表达分析,并构建了35S::FvSPL2过表达载体。结果表明：FvSPL2基因编码区全长639 bp,编码212个氨基酸;蛋白质理化性质和结构分析表明FvSPL2蛋白为不稳定亲水性蛋白,其含有高度保守的SBP结构域和一个核定位信号NLS。RT-qPCR分析结果显示FvSPL2基因在花中表达量最高,在叶柄和叶片中次之。此外,该基因在不同花期表达先上升后下降,在半开花中表达量最高,且与花苞和全开花差异显著。这些结果说明该基因主要参与开花调控过程。研究结果为后续研究FvSPL2基因在森林草莓中的生物学功能提供数据依据。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

棉花多胺氧化酶基因(GhPAO_2)的克隆及非生物胁迫下的表达分析

本研究以拟南芥多氨氧化酶(AtPAO2)为探针,在雷蒙德氏棉基因组数据库中获得同源基因并设计引物,利用RT-PCR技术克隆PAO基因,分离一个新的陆地棉PAO基因命名为GhPAO2。该基因cDNA全长为2 237 bp,具有一个1473 bp的开放阅读框,编码490个氨基酸残基,预测该基因蛋白质分子量为54.41 kD,等电点为5.69。利用Real-time PCR对该基因在不同组织和多种非生物胁迫处理进行表达分析,结果表明:GhPAO2基因主要在棉花花瓣和叶中表达;不同胁迫处理下GhPAO2基因表达量均发生显著变化,其中低温处理和20%PEG处理后基因表达量迅速上升并在1 h时表达量达到最高,200 mmol/L NaCl和1 mmol/L ABA处理则在24 h时表达量达到最高,表明GhPAO2基因受低温、PEG、Na Cl和ABA诱导表达,可能在棉花抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

苹果MdSGR2基因克隆及植物超表达载体构建

STAYGREEN(SGR)基因在植物叶绿素降解代谢过程中起重要作用。为探究苹果SGR2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术从澳洲青苹成熟果皮中克隆得到MdSGR2基因,利用生物信息学分析软件对其编码蛋白进行了同源性、理化性质、蛋白结构、启动子顺式作用元件等预测和分析,并构建其植物超表达载体。结果表明,MdSGR2基因完整开放阅读框(ORF)cDNA序列为840 bp,编码279个氨基酸,该蛋白属于Staygreen超家族。理化性质分析表明,该蛋白分子质量为31.27 ku,等电点pI为8.52,属不稳定亲水蛋白。同源性分析表明,MdSGR2蛋白与秋子梨SGR同源性最高,达84.12%。蛋白质结构分析表明,该蛋白二级结构和三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲构成,二者比例分别为40.50%,44.44%。启动子分析表明,该基因启动子区域包含低温顺式作用元件、光响应元件和脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯响应元件等诱导型顺式作用元件,说明MdSGR2基因可能受环境和激素等多种因素的调控。同时研究成功构建了MdSGR2基因植物超表达载体pCAMBIA2301-MdSGR2。     

多胺、二胺氧化酶和多胺氧化酶与大麦白粉病抗性的关系

在接种白粉病分生孢子后或没有白粉病的情况下，调查了大麦第一片叶中的多胺水平、二胺和多胺氧化酶活性。试验材料为Chariot(抗)和Golden Promise(感)两个品种。Chariot叶片中腐胺、亚精胺和精胺水平高于Golden Promise，除精胺外，接种后两个品种叶片中腐胺和亚精胺水平都较高。在Chariot的接种叶片中，腐胺和亚精胺分别于接种后第9天和12天达到峰值。     

花生AhLrK10的基因克隆、表达载体构建及表达分析

铝毒害严重影响着花生的生长发育和产量。为了探究花生类受体蛋白激酶对铝胁迫的响应及调控,本研究基于对已有转录组数据的分析,克隆得到一个铝胁迫响应类受体蛋白激酶基因AhLrK10。序列分析发现AhLrK10全长1 716 bp,编码571个氨基酸。AhLrK10蛋白含有信号肽、跨膜域、保守的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶结构域,相对分子量为64.5 kD,理论等电点为7.87,二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。系统进化分析表明花生AhLrK10与红豆ApLrK10具有较近的亲缘关系。通过同源重组技术将AhLrK10全长克隆到pCAMBIA1301载体上,并转化至农杆菌GV3101。运用RT-qPCR,分析了AhLrK10在不同组织及不同铝胁迫时间下的表达。组织特异性表达分析表明,在‘ZH2’中,AhLrK10表达无组织特异性,在‘99-1507’中,AhLrK10在幼果的表达量最高。铝胁迫表达分析发现,在‘ZH2’中,AhLrK10受铝胁迫诱导显著上调表达,在‘99-1507’中,AhLrK10受铝胁迫表达无显著差异。本研究为铝胁迫条件下RLKs功能的深层挖掘提供理论基础。     

花生AhCDPK32基因克隆及表达载体的构建

利用RT-PCR方法,从花生品种汕油21成熟种子中克隆了钙依赖蛋白激酶(camcium-dependent protein kinase,CDPK)基因Ah CDPK32,该序列包含1 617 bp开放阅读框,共编码538个氨基酸。核苷酸序列在NCBI中进行Blast比较,结果显示与大豆Gm CDPK32(Gen Bank登录号为XM_003554131)基因同源性为87%。生物信息学分析结果,预测蛋白质分子量为60.807 k D,蛋白质等电点(PI)为6.96,蛋白质信号肽分析和疏水性分析,表明信号肽剪切可能性小,蛋白质具亲水性。我们构建了该基因超表达载体p CambiaAh CDPK32,为进一步研究该基因的功能提供了理论基础。这是第一次在花生中克隆到CDPK基因的报道。     

拟南芥CAX 1基因克隆及表达载体的构建

传递逆境胁迫如盐胁迫、干旱胁迫和病菌感染响应的重要第二信使是钙离子,而且在拟南芥植物细胞内,钙离子浓度受到严格的控制。CAX 1定位于液泡膜,是将钙离子存储于液泡的钙离子通道。利用PCR技术从拟南芥植物中的cDNA扩增出基因CAX 1。在此基础上将扩增出来的含有CAX 1基因片段与pMD 18-T载体连接得到重组质粒,再连接在pBI 121质粒的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,转化在感受态的大肠杆菌后经过培养,并进行菌落PCR验证和酶切鉴定,以期为研究转运蛋白CAX 1过量表达株系是否影响植物抗病提供参考。     

拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建

BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能.DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量.本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542 bp的特异性...     

木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

木糖还原酶是木糖醇生物合成的关键酶,催化木糖合成木糖醇。以实验室筛选并经分子生物学鉴定为季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因为基础,以酵母表达载体pPICZαA成功构建了含有木糖还原酶的重组表达载体pPICZαA-xyl,为进一步研究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础。     

蒙古沙冬青AmNAC1和AmNAC2的表达分析与植物表达载体构建

NAC转录因子为植物所特有,是植物抗逆信号转导途径的关键组分,可通过激活许多抗逆功能基因的表达而使植物形成抗逆保护机制。本研究利用RT-qPCR方法分析了强抗逆植物蒙古沙冬青AmNAC1和AmNAC2基因在低温和脱水胁迫下的表达变化。结果表明其表达均受这两种胁迫的诱导而显著上调。同时利用PCR方法克隆到这两个基因的编码区cDNA和gDNA。其gDNA中均含有两个内含子序列。推测AmNAC1和AmNAC2的编码蛋白分别由351个和292个氨基酸残基组成,其氨基酸序列中均含有一个保守的NAC结构域。此外成功构建了两个基因的植物超表达载体。这些工作为进一步鉴定AmNAC1和AmNAC2的功能提供了参考依据。     

花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建

核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分,在细胞内蛋白质生物合成过程中具有重要作用。RPL29-1是核糖体大亚基60S的一个组件。本研究以花生品种日花1号为材料,利用RACE方法成功得到RPL29-1基因的c DNA序列,并获得DNA序列。RPL29-1基因c DNA序列包括186 bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。RPL29-1基因DNA序列含有两个外显子和一个内含子。一级结构分析表明,RPL29-1蛋白质分子量为7 127.02 Da,等电点为10.29。本研究采用荧光定量技术(q RT-PCR)分析了RPL29-1基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了RPL29-1的过表达载体和反义表达载体,为进一步通过功能分析研究花生RPL29-1基因在抗青枯病中的作用奠定基础。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

牛抑制素α亚基基因克隆及表达载体的构建

为克隆牛抑制素α亚基基因,构建抑制素pET32a-成熟肽表达载体,从河北大厂县屠宰场采集卵巢,提取总RNA并反转录成cDNA,根据GenBank NM_174094.4 设计一对引物扩增出成熟肽cDNA,将所扩增基因插入到pET32a 表达载体BamHⅠ与HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒抑制素pET32a-成熟肽。结果成功构建出抑制素α亚基基因。笔者初步得到了抑制素重组质粒,为今后重组蛋白原核表达的研究奠定了基础。