pBⅠ121载体酶切位点添加及拟南芥Na~+/H~+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列(SacⅠ-EcoRⅠ)通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加,即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现,两个酶切位点的添加是成功的,但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异,即有4个碱基发生了变异,特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白(GFP)对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测,结果发现,它与携带GFP的pBI121载体一样,GFP基因能正常表达,说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体(pBI121-GZ)构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

蓖麻质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(RcSOS1)克隆及表达载体构建

根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到RcSOS1(NCBI注册号:KX943304.1)基因序列,开放阅读框包含3 432个核苷酸,推导编码的蛋白质有1 143个氨基酸残基组成,与麻疯树SOS1基因的同源性最高,达到了80.4%,编码一种Na~+/H~+逆向转运蛋白。疏水性分析显示RcSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。RcSOS1蛋白二级结构以α-螺旋,无规则卷曲为主,其次为延伸链和β-转角,所占比例最少。三级结构分析表明,RcSOS1蛋白是位于质膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白。根据RcSOS1全长序列设计带有Bam HⅠ和SalⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切后与表达载体p CG-1301连接,成功构建了RcSOS1基因的正义表达载体,为深入研究RcSOS1基因的功能及耐盐的调控作用提供了帮助。     

转大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白GmNHX1基因植株的获得

制约大豆生产的因素很多,土壤盐渍化就是其中之一。大量研究证明过表达NHX逆向转运蛋白可以提高植物的耐盐性。为获得耐盐性良好的转基因大豆材料,我们将大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白(GmNHX1)基因构建到植物表达载体pCAMBIA3300上,应用农杆菌介导法将GmNHX1导入大豆品种黑农56和黑农59中,共获得18个转基因株系,并对T_1代转基因株系进行了PCR和实时荧光定量PCR检测。PCR结果表明转基因后代株系呈阳性的植株有4株;经Real-time PCR检测该4个PCR阳性转基因株系的G NHX1基因表达水平均高于对照株系;200 mmol/L NaCl溶液的盐试结果表明;对照植株的生长速度滞缓于4个转基因株系的生长速度。     

毛偃麦草Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦和长穗偃麦草的液泡膜Na+/H+逆转运蛋白基因(TaNHX1、TeNHX1)全长序列设计引物,通过RT.PCR直接扩增的方法从毛偃麦草(Elytrigia trichophora L.)中克隆到了Na+/H+逆转运蛋白基因,命名为EtNHX1 (Accession numeber:EU876834).EtNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kD的蛋白,预测等电点8.0.EtNHX1含有39个碱性氨基酸,37个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及128个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约47%的α-螺旋、20%的延伸链、4.5%的β-转角和28%的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,EtNHXl含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成跨膜螺旋.序列分析显示,EtNHX1与小麦(Triticum aestivum L.)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium L.)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)、水稻(Oryza sativa L.)、角果碱蓬(Suaeaa corniculata L.)、小盐芥(Thellungiella halophila L.)等植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为98%、98%、96%、85%、68%和67%.序比对结果以及进化树分析均表明EtNHX1应为定位于毛偃麦草液胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白.     

转Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(nhaA)大豆植株的获得及耐盐性分析

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,是影响作物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白能够通过将Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中来调节细胞内的离子平衡,是植物耐盐的关键因子。本研究将质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节,获得6株卡那霉素抗性再生植株。对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,3株植株呈阳性,平均转化率为0.42%。对阳性植株的耐盐生理指标测定结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。nhaA基因在大豆植株中的表达显著提高了大豆对盐胁迫的耐受性,为大豆耐盐新品种的选育和广泛应用该基因进行其它农作物的耐盐性改良提供了材料和依据。     

水稻多胺转运蛋白OsPUT1基因RNAi载体的构建及遗传转化

在植物中,多胺(腐胺,亚精胺和精胺)参与许多生理过程,包括胚胎发育、器官形成、花芽发育,叶片衰老,花粉管生长、果实的发育和成熟,生物和非生物胁迫的响应。但是,PAS具有内在毒性和多重功能,细胞内的PA含量受到严格控制,受转运体的调节。因此,在水稻中研究水稻多胺转运蛋白OsPUT1的功能至关重要。本研究以水稻多胺转运蛋白基因OsPUT1为研究对象,通过构建OsPUT1-RNAi载体,借助根癌农杆菌介导水稻遗传转化,将OsPUT1的RNAi表达框转到水稻基因组中;经过PPT抗性筛选与PCR鉴定,成功获得了34株转基因水稻。对其中的7株转基因苗进一步作RT-PCR检测,显示有5株OsPUT1基因表达下调,实现了设计目标。这些转基因水稻为进一步研究OsPUT1的功能与作用机制提供了良好的遗传材料。     

pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列（Sac Ⅰ-EcoR Ⅰ）通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加，即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有4个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白（GFP）对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带GFP的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体（pBI121-GZ）构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

马铃薯RPP13基因RNAi载体的构建及遗传转化

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基...     

棉花液泡膜H~+-ATPase A亚基的克隆及表达载体的构建

液泡膜H+-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用,对其关键亚基基因的克隆及分析,有助于阐释V-ATPase在逆境下的调节及响应机制。本研究利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个液泡膜H+-ATPase亚基A基因,命名为Gh VHA-A。该基因ORF为1 872 bp,编码623个氨基酸,预测的蛋白质理论分子量为68.41 k D,等电点为5.17。通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,Gh VHA-A与可可V-ATPase A亚基的同源性最高,达到97.9%,在进化上亲缘关系较近;且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与ATP或GTP的磷酸基团相互作用的保守结构域GAFGCGKT和PSVNWLISYS,说明A亚基是相对保守的。本研究构建了植物表达载体p CAMBIA 1304-VHA-A,并转入到根癌农杆菌(GV3101)中,为后续研究棉花V-ATPase A亚基基因在干旱胁迫应答中的功能奠定试验基础。     

水稻(Oryza sativa)新型液泡Na+/H+逆向转运蛋白基因的特征分析和表达

以拟南芥AtNHX1 cDNA 片段作为探针,筛查水稻盐胁迫植株叶片cDNA 文库,获得与AtNHX1同源的水稻新型液泡Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（OsANT1）。序列分析表明,OsANT1 全长cDNA为2 178 bp,包括一个长度为1 608 bp的完整开放阅读框,编码535个氨基酸残基。在DNA水平上,OsANT1基因含有15个外显子和14个内含子,长度为4 835 bp。OsANT1含有12个跨膜域,系统进化树分析结果表明,与来自拟南芥、水稻、小麦、玉米、大麦、马蔺和芦苇等的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白高度同源。盐胁迫条件下,OsANT1的表达具有盐分诱导特征,且随着胁迫的增大而增加。表明该基因可能在水稻抵御盐分胁迫的过程中具有一定作用。     

烟草orf25基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

杂种优势的利用可以有效地实现烟草高产、高抗、优质的育种目标,目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。研究发现orf25基因位于线粒体基因组中,与烟草雄性不育密切相关。本研究以烟草雄性不育相关基因orf25为研究对象,根据RNA干扰载体构建原则,将长度为606 bp的orf25基因干扰片段分别以正向、反向连接到大小为190 bp的linker连接片段的两侧,构成发夹结构的RNA干扰载体片段。将RNA干扰载体片段插入到中间载体pET30a上,最后克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建orf25基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi转入到烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%。结果表明pCAMBIA1301-orf25-RNAi干扰载体已成功转入到烟草中烟90中。     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

水稻抗旱基因OsbHLH120 RNAi干扰载体的构建及遗传转化

OsbHLH120是一个参与非生物胁迫响应基因,与水稻的抗旱性密切相关。本研究根据RNAi表达载体设计原则,从水稻日本晴基因组DNA扩增OsbHLH120基因片段,将长度400 bp干扰目的片段通过正反两个方向与载体p TCK303连接。从pTCK303载体的启动子、终止子和Rice Itron结构中设计两对检测引物,直接将检测引物的PCR产物测序验证载体是否构建成功。通过农杆菌介导法将构建的OsbHLH120RNAi干扰表达载体导入水稻品种日本晴,获得18株转基因阳性苗。本研究结果将有利于进一步研究OsbHLH120在水稻抗旱过程中的作用。     

紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化

根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。     

筇竹Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆与表达分析

为明确液泡型Na+/H+逆向转运蛋白在竹类植物耐盐中发挥的重要作用.本研究从筇竹中克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为QtNHX1(基因登录号:MT078987),并分析该基因表达特征.结果表明,QtNHX1基因全长为2 075 bp,包含1 632 bp的开放阅读框(编码544个氨基酸),其相对分子量为5...     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

刺槐Na+/H+逆向转运蛋白RpNHX1基因的分离和生物信息学分析

盐分胁迫严重影响植物生长和产量.为了研究木本植物对盐分的适应性,利用5'RACE技术,从刺槐中克隆得到液泡Na /H 逆向转运蛋白基因RpNHX1.该基因长度为2 281 bp,含有一个开放阅读框,编码535氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列与大豆GmNHX1和拟南芥AtNHX1相似,氨基酸的同源性分别达85%和69%,RpNHX1属于NHX亚族的NHX-I分枝.用生物信息学的方法预测RpNHX1具有所有Na /H 逆向转运蛋白共同的结构特点,即含有疏水的N末端,10个跨膜螺旋区域和一个具有调节功能的C端亲水区域,其中氨氯吡嗪咪敏感基序和CaM结合域也是保守的.在4和5的螺旋区域之间,存在有一串带负电荷氨基酸,显示出有规律的排列模式,这些模式在生物界中的Na /H 转运蛋白中是保守的.结合亲疏水资料,我们认为Na /H 转运通道结构可能存在于这一区域.另外,也分析了RpNHX1可能的糖基化、酰基化和磷酸化位点.从这些数据中可以看出,RpNHX1可能在细胞中起到Na 区隔化作用.