番茄脂肪氧化酶D基因的克隆分析和植物表达载体的构建

利用RT-PCR方法从番茄中克隆了TomloxD的cDNA。采用生物信息学,ChloroP,SMART方法对TomloxD分析与研究,结果表明,TomloxD基因编码是一个由908个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量为102.31 kD。在蛋白的N-端有77个氨基酸组成的叶绿体信号肽。TomloxD是一种植物脂肪氧化酶,具有两个保守结构域:在靠近N-端区域有PLAT/LH2结构域,在C-端有pfam:lipoxygenase结构域。TomloxD蛋白与大豆LOX3蛋白三维结构高度重叠。TomloxD与来自马铃薯、烟草、油橄榄、拟南芥和玉米的脂肪氧化酶的一致性分别为96%、90%、82%、72%和67%。系统进化关系分析表明TomloxD与来源于双子叶植物的脂肪氧化酶蛋白的亲缘关系更近,而与单子叶植物的相对较远。构建植物高效表达载体TomloxD-pBIN19,并导入根癌农杆菌LBA4404中,得到植物转化工程菌,这为下一步用于番茄等作物的转基因操作,进一步研究TomloxD基因的功能,获得高抗逆性的转基因作物奠定了基础。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

甘薯zds基因的克隆与植物表达载体构建

β-胡萝卜素是维生素A原,对人体健康具有重要作用,可降低多种癌症特别是肺癌的发病率.ζ-胡萝卜素脱氢酶是β-胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一.根据其它植物ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(zds)的保守序列,设计简并引物,从甘薯块根总RNA逆转录的cDNA中扩增出608 bp的zds保守序列,然后用RACE技术扩增出该基因的全长cDNA.zds全长cDNA共2057 bp,有一1773 bp的开放阅读框,编码591个氨基酸,相对分子质量为65 ku.并成功构建了zds植物表达载体p2300-zds,可进一步用于提高作物β-胡萝卜素含量的遗传转化研究.     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

除虫菊CPPase基因的克隆及植物表达载体的构建

用RT-PCR方法从除虫菊花中扩增了菊酰焦磷酸合成酶（CPPase）的全长cDNA序列．测序分析结果表明,该基因编码区为1185bp,编码由395个氨基酸组成的多肽．CPPase能定位于叶绿体,具有质体转运肽,还具有异戊烯基转移酶家族成员所特有的2个天冬氨酸富集基序．通过引物两端的酶切位点将CPPase基因定向克隆到植物表达载体pBl 121中．经PCR和酶切鉴定分析,获得了除虫菊CPPase基因的正、反义植物表达载体pBI121-CPSs和pBl 121-CPSas．     

籼稻VQ6基因的克隆与植物表达载体构建

采用CTAB法提取籼稻的基因组DNA;根据TIGR数据库中Os VQ6基因序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增成功地获得了籼稻Os VQ6基因。该基因具有VQ结构域,其编码区全长为351 bp,编码116个氨基酸残基。经T载体连接转化后测序,进一步构建了Ca MV 35S启动子驱动Os VQ6基因的植物表达载体p SN1301-Os VQ6。     

玉米ZmCBL6基因的克隆及其植物表达载体构建

类钙调磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like proteins,CBLs）是植物中1类重要的Ca2＋结合蛋白,由其所介导的Ca2＋信号途径广泛参与植物对多种非生物胁迫和某些生长发育信号的应答反应。本论文以水稻OsCBL6序列在GenBank数据库进行TBLASTN查询,获得其在玉米中推测的同源基因ZmCBL6的全长cDNA序列,然后用RT-PCR方法对ZmCBL6基因的编码框cDNA进行了克隆,用生物信息学方法对其编码蛋白的功能域、系统进化和亚细胞定位等进行了分析,并构建了其植物表达载体,为进一步研究其亚细胞定位和通过转基因植物等验证其功能奠定了基础。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

籼稻VQ6基因的克隆与植物表达载体构建

采用CTAB法提取籼稻的基因组DNA;根据TIGR数据库中Os VQ6基因序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增成功地获得了籼稻Os VQ6基因。该基因具有VQ结构域,其编码区全长为351 bp,编码116个氨基酸残基。经T载体连接转化后测序,进一步构建了Ca MV 35S启动子驱动Os VQ6基因的植物表达载体p SN1301-Os VQ6。     

玉米淀粉分支酶基因片段的克隆和植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析,测定了DNA全序列。结果表明：克隆片段全长为935bp。将反义 正义基因片段插入到pB1121 35S启动子下,构建成表达质粒pCJSBE2b。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株。     

黄瓜磷脂酶D基因片段克隆及其反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法,从新泰密刺黄瓜的幼叶中得到长为1018 bp的cDNA片段,编码339个氨基酸,与GenBank中甜瓜磷脂酶D基因相比核苷酸同源性为96%,氨基酸同源性为97%.克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构成磷脂酶D基因的反义表达载体.     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

拟南芥抑芽基因SPS的克隆及植物表达载体的构建

通过PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆了SPS基因,序列分析表明,与Genebank公布的序列完全一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体pBI121上,并将载体pBI121上的CaMV35S启动子替换为烟草伤诱导启动子POD,构建成植物表达载体pBISPSPOD。     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

玉米ZmCIPK6基因的克隆及植物表达载体的构建

根据MaizeDGB数据库中ZmCIPK6基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因c DNA全长1 739 bp,5′-非编码区长281 bp,3′-非编码区长111 bp,编码区长1 347 bp,编码448个氨基酸,预测分子量为48.8 KDa,等电点为9.14。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK6与高粱SbCIPK6同源性较高。根据ZmCIPK6的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pMD18-T-ZmCIPK6为模板,PCR扩增ZmCIPK6基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建成该基因的植物表达载体。经PCR检测及测序鉴定,表明成功构建了ZmCIPK6基因的植物表达载体,为进一步遗传转化研究基因的功能奠定基础。     

山腊梅几丁质酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

本研究利用RT-PCR技术扩增山腊梅几丁质酶基因,对几丁质酶基因的序列进行生物信息学分析,同时成功构建植物表达载体,为植物几丁质酶基因功能的研究提供理论基础。