CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻育种应用的研究进展

土壤退化、气候变化、生物和非生物胁迫的不利影响,对保障中国粮食生产安全和稳定提出了新的挑战.为了更快地实现水稻育种目标,在育种改良中整合分子育种新技术是当务之急.CRISPR/Cas9基因编辑技术具有时间周期短、操作简便快捷、编辑效率高等优点,已成为植物科学和水稻分子育种的重要工具,在水稻种质资源创制和遗传改良中得到广...     

CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用

CRISPR-Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,实际操作中只需对向导RNA起始的20个核苷酸进行修改即可完成对不同靶标基因的编辑,该技术以其简便、高效的特点,迅速成为动植物中最为广泛使用的基因组编辑工具。本研究对CRISPR-Cas9系统进行了简单的介绍,总结了CRISPR-Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用,并针对该系统存在的脱靶效应,提出了几点策略,最后对CRISPR-Cas9基因组编辑技术与转基因技术之间的关系进行了探讨,并对CRISPR-Cas9系统在进一步扩大水稻基因组编辑范围、调控基因表达水平等方面进行了展望,以期为研究该方面工作的水稻育种家提供参考。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制新型水稻温敏雄性核不育系

为迅速获得优良的温敏雄性核不育(TGMS)系,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对一份优良的水稻品系GXU41的TMS5基因上2个靶点进行编辑,对编辑植株进行靶点突变检测,筛选无外源DNA的编辑TGMS系,并进行育性转换、农艺性状和米质分析评价。结果共获得12株T0代转基因阳性植株,其中靶点1和靶点2的纯合突变率分别为50%和58.4%,一个或两个靶点为纯合突变占83.3%,双纯合突变率达到25%,在T1代中筛选到无外源DNA的TGMS系。与野生型相比,编辑获得的TGMS系GXU41-5S随着温度升高小穗育性和花粉育性逐渐降低,在24℃时均表现完全不育;由于不育效应,GXU41-5S的株高增长和有效穗数增加显著,且GXU41-5S全部米质指标达到优质一等大米的标准要求。本研究证明了CRISPR/Cas9基因编辑系统是快速获得TGMS系有效途径,所创制的TGMS系对选育两系杂交水稻品种具有重要应用价值。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS

tms5是生产上应用最广泛的温敏不育基因。为创制新型水稻温敏核不育系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将6个优异的粳稻和4个优异的籼稻的TMS5基因敲除,获得了温敏核不育系。比较发现,粳稻温敏不育系ZG75S、CYGS、YG0618S、ZG07S、T0361S、7679S的不育起点温度在28～32°C之间,籼稻温敏核不育系2537S、6150S、6379S的不育起点温度在24～28°C之间,而籼稻温敏核不育系1109S的不育起点温度低于23.5°C。说明不同遗传背景材料获得的tms5突变体的不育起点温度不一样,通过TMS5的敲除可能获得不育起点温度较低的温敏核不育系。利用1109S与优质父本8048选配出优质高产杂交稻组合1109S/8048。大田试验表明, 1109S/8048比区试对照丰两优4号增产13.1%。温敏核不育系1109S及高产杂交稻组合1109S/8048的创制为高产育种提供了新的途径。     

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改良大粒香稻瘟病抗性

优质稻米大粒香是采用粳籼杂交方法育成的香稻品系,多年来是贵州省优质稻米企业开发生产的主推品种.但稻瘟病抗性差,限制了其大规模推广应用.本研究以大粒香为材料,根据CRISPR/Cas 9靶点设计要求设计稻瘟病基因pid3特异性靶点sgRNA序列,构建crispr-pid3双靶点载体,通过农杆菌介导遗传转化大粒香愈伤组织,...     

利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中。通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应。本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止。利用种皮特异启动子控制表达的m Cherry荧光蛋白,可以在T_1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系。对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调。这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsABI5突变体

在水稻种植生产上,因其种子经常发芽率不齐,导致水稻直播困难,不仅影响水稻的生产成本还影响其产量,因此水稻直播的突出问题要保持优良的种子萌发力。ABA是种子萌发的抑制因子,它通过诱导ABI5的表达来抑制种子萌发,在种子正常萌发的过程中,随着种子吸胀和GA生物合成,ABA和ABI5的含量都迅速下降,促使种子萌发。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建OsABI5突变体,以期提高种子的萌发率和萌发速度。通过农杆菌介导法将构建好的OsABI5敲除质粒转化‘日本晴’水稻的愈伤组织,经PCR和Western Blot鉴定筛选得到两株OsABI5弱表达的阳性突变株系。通过对osabi5-2突变体和‘日本晴’萌发表型的观察,发现osabi5-2突变体2 d发芽率显著高于‘日本晴’,二者4 d的萌发势也是osabi5-2突变体略高。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsABI5突变体,对研究水稻OsABI5调控种子萌发的分子机制具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS5

Thermo-sensitive genic male-sterile (TGMS) gene tms5 is most widely used in the two-line hybrid breeding system in China. To develop novel rice thermo-sensitive male sterile lines, we knocked out the TMS5 genes of six elite japonica and four indica rice varieties by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. By analyzing the critical sterility-inducing temperature (CIST) of the newly TGMS lines, it was found that the CIST of japonica TGMS lines ZG75S, CYGS, YG0618S, ZG07S, T0361S, and 7679S were between 28°C and 32°C, the CIST of indica TGMS lines 2537S, 6150S and 6379S were between 24°C and 28°C, and the CIST of indica TGMS line 1109S was lower than 23.5°C. These results indicated that the CIST of tms5 mutant from different genetic background materials was different. The TGMS lines with lower CIST could be obtained by knocking out the TMS5 from different genetic background materials. A hybrid rice combination 1109S/8048 had high quality and high yield. The yield of 1109S/8048 was 13.1% higher than that of Fengliangyou 4. The creation of the TGMS 1109S and the high-yield cross combination 1109S/8048 provides a new way for high-yield breeding.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体

GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种‘9522’,鉴定并获得遗传转化植株。对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基。对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522~(G540-1)、9522~(G540-2)和9522~(G540-4)的RPT1和GRAS结构域完全缺失,即成功获得以‘9522’为背景的G540功能缺陷型突变体。为进一步探究该基因在穗发育进程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻过氧化氢酶基因OsCAT

过氧化氢酶(catalase,CAT)作为重要的抗氧化酶,可催化细胞内过氧化氢的分解,为了研究水稻过氧化氢酶基因OsCAT2的功能,首先根据在线软件http://crispr.mit.edu/搜寻向导sg RNA序列,选择OsCAT2基因第三外显子上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作为目标靶序列,然后构建了OsCAT2的CRISPR/Cas9载体BGK03-OsCAT2,将目的载体转化水稻粳稻9522后共获得了7个独立的转基因株系,其中包括在PAM附近发生编辑的独立转基因株系2个,编辑方式主要表现为缺失和错配。与野生型相比,转基因植株较矮、分蘖数增加、叶片呈明显的病叶状、成熟时期育性明显降低,这为深入研究水稻OsCAT2基因的作用机制提供了帮助。     

CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

油酸脱氢酶((35)12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶,它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明, AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因,决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。本研究根据AhFAD2基因序列,设计了相应sgRNA序列,并构建了旨在敲除FAD2A和FAD2B两个花生油酸脱氢酶的CRISPR/Cas9基因编辑载体。经花生基因转化后,通过对转基因花生突变位点基因组序列分析找出基因突变体。对靶基因分析发现,16株转基因花生含有29个FAD2A基因突变,其中16个突变引起蛋白质序列变化;11株转基因花生含有30个FAD2B基因突变,其中17个突变引起蛋白质序列变化。FAD2A和FAD2B蛋白质序列的变化可影响花生油酸脱氢酶的活性,改变油酸催化脱氢,使亚油酸合成受阻,油酸含量增加。本研究为研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育种提供了宝贵的基因突变体材料。     

CRISPR/Cas 9基因编辑技术降低贵州禾株高研究

为获得株高降低的贵州禾水稻新种质,以贵州禾高秆糯稻材料黎平杂边禾为研究材料,根据CRISPR/Cas 9靶位点设计原则设计水稻OsGA20ox2基因的特异性靶点sgRNA序列,构建水稻OsGA20ox2基因的CRISPR/Cas 9定点突变载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法遗传转化黎平杂边禾,通过潮霉素筛选,以及PCR分子检测,获得16株转基因植株。对筛选获得的转基因植株基因进行测序,获得7株OsGA20ox2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。研究表明,T_1代突变体植株株高比黎平杂边禾降低了29.6%。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsSLR1敲除突变体

GA是种子萌发的促进因子,能解除种子休眠和刺激萌发,GA的信号通路可以通过对DELLA蛋白的去抑制作用来完成的。通过对不同物种的DELLA蛋白功能的研究,发现不同物种的DELLA蛋白的功能具有高度保守性,本实验主要研究水稻中的DELLA蛋白SLR1,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsSLR1基因敲除突变株。首先,通过对OsSLR1的结构和功能域进行分析比对,最终选择3个靶点;然后,利用重组法构建CRISPR/Cas9敲除载体;最后,通过农杆菌介导法,将敲除载体转染成熟的日本晴水稻愈伤,待培育出幼苗,通过PCR和Western Blot进行鉴定。最终筛选得到1株Os SLR1敲除突变株系slr1-1,通过观察突变体萌发表型,发现slr1-1突变体第2天发芽率显著高于日本晴,而且slr1-1突变体的生长速度显著快于日本晴。通过不同浓度PAC对slr1-1突变体萌发表型的影响,发现水稻的DELLA蛋白SLR1敲出的突变体种子萌发不受PAC抑制,表明OsSLR1是通过调控GA信号途径影响水稻种子的萌发,详细的调控机制和互作蛋白等还有待深入的研究。通过对SLR1调控GA信号通路控制水...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。     

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑文库筛选在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,但其在木本植物中的应用仍处于初级阶段。本研究总结了CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑文库构建方面的应用,探究该系统如何应用于构建突变敲除体库。将构建基因编辑突变体文库作为深入研究基因功能的手段,本研究综述的信息将对推进木本植物相关研究提供有益的借鉴。     

CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础。为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑。根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分析靶位点特异性,最终构建一个双靶点的CRISPR/Cas9敲除载体。以粳稻品种‘中花11’作为受体,使用农杆菌遗传转化法转化受体获得21株T0代转化苗,通过对潮霉素抗性基因进行检测获得17株阳性苗。对17株阳性苗的2个靶位点分别进行测序分析,有13株在靶位点1发生编辑,突变频率为76.4%。全部植株都在靶位点2被成功编辑,突变频率为100%。不同靶位点发生的突变样式有较大差异。设计InDel标记用于重点株系10的分子标记辅助选择育种,最终获得无T-DNA成分的普通粳稻核不育系。本研究创制的新的rms2突变体和不含转基因成分的rms2粳稻不育系,不仅丰富了rms2的突变类型,也为进一步研究GDSL脂肪酶功能和粳型第三代杂交水稻创制了重要的材料。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定

利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1植株,从23个T1株系筛选获得107个不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,获得了21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。对接种水稻样品的6个病程相关基因进行q RT-PCR分析,与感病日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因诱导表达的速度更快,表达量更高。本研究利用基因编辑技术,实现了对感稻瘟病水稻的定点突变并提高了其稻瘟病抗性水平,为利用该技术培育持久抗稻瘟病水稻品种奠定了研究基础。