白桦2个bZIP基因的克隆及表达分析

在本研究中,以白桦总cDNA为模板,扩增出2个bZIP基因并成功构建到T载体上;通过对白桦的根、茎、叶进行不同时间的盐胁迫处理,利用实时荧光定量PCR技术分析2个bZIP基因在胁迫下的表达情况,结果表明:2个bZIP基因在不同组织以及不同时间盐胁迫下表达量呈现不同的变化趋势,说明这2个bZIP基因能够被逆境胁迫胁迫诱导表达。本实验为后续研究bZIP基因在白桦中的功能提供前期数据参考,并为进一步的白桦遗传改良工作提供了帮助。     

玉米Dof转录因子的全基因组鉴定和表达模式分析

为了研究玉米中Dof转录因子家族功能,本研究利用生物信息方法,在全基因组水平对玉米Dof转录因子进行鉴定,并对其理化性质、系统进化、保守结构域、共线性和表达模式进行了系统分析。结果表明,共有46个玉米Dof转录因子被鉴定到,它们不均等分布在9条染色体上。多序列比对发现所有的ZmDof均具有1个保守的C2-C2单锌指结构域。系统进化分析将Dof分为4个亚组,其中亚组I和III是最大的亚组,均包含有30个水稻、拟南芥、玉米Dof转录因子。共线性分析发现ZmDof与二穗短柄草、水稻、高粱Dof基因分别组成了22、37、37对共线性基因对,说明它们具有很好的基因共线性关系。表达模式分析发现所有的ZmDof基因表现特异性表达,说明它们在植物生长发育阶段发挥着重要作用。本研究结果为进一步分析玉米Dof转录因子家族的功能提供了重要依据。     

陆地棉Dof基因家族的全基因组鉴定及分析

【目的】单锌指DNA结合蛋白(DNA binding with one finger, Dof)是1类植物特有的转录因子,在植物生长发育与非生物胁迫响应中发挥非常重要的作用。本研究旨在对陆地棉Dof转录因子家族进行全基因组分析,为深入研究Dof基因参与植物生长发育的调控机制提供参考。【方法】基于最新发布的陆地棉基因组数据,利用生物信息学手段对陆地棉Dof基因家族进行全基因组鉴定,并系统分析Dof基因家族成员的理化性质、序列特征、基因复制、系统进化和表达谱。【结果】陆地棉中一共鉴定出118个Dof基因。经聚类分析将其分成9个亚家族,同一亚家族的陆地棉Dof基因有相似的内含子/外显子和基序分布模式。基因复制分析表明,全基因组复制可能导致陆地棉Dof基因的扩增。陆地棉Dof基因启动子区域存在不同植物激素和逆境胁迫响应元件。转录组分析表明,陆地棉Dof基因在不同的组织、发育时期和逆境胁迫下聚为3个表达模式不同的类群,暗示了其功能多样性。【结论】陆地棉Dof基因家族的全基因组鉴定和分析,有助于了解其进化和功能,为后续研究提供重要参考。     

青狗尾草Dof基因家族的全基因组鉴定及组织特异性表达分析

青狗尾草是禾本科狗尾草属的一种草本植物,随着基因组测序的完成,青狗尾草逐渐发展成为抗旱耐逆研究的模式植物。Dof(DNA binding with one finger)是植物特有转录因子基因家族之一,在植物生长发育的一系列生理生化反应过程中发挥重要作用。本研究对青狗尾草Dof转录因子基因家族的基因在染色体上的位置、基因结构、编码蛋白的理化性质和系统发育等方面进行分析。此外,还对该基因家族成员在不同的组织器官、发育阶段的表达进行了分析。研究结果发现青狗尾草基因组中存在36个Dof基因,命名为Sv Dof1~Sv Dof36。通过对青狗尾草、谷子、高粱、水稻和拟南芥Dof蛋白的系统发育关系分析,Dof基因家族可被分为6个亚组(Group 1~6)。利用狗尾草转录组数据,进一步研究了狗尾草Sv Dof基因在10中不同组织器官中的表达情况,结果显示Sevir.8G018500和Sevir.1G022000基因只在胚芽鞘中表达,Sevir.8G184900在叶分生组织和花序分生组织中呈现特异性表达,预示着这些Dof基因可能参与特定组织的发育。本研究结果为下一步鉴定Sv Dofs基因功能提供基础。     

油梨Dof基因家族鉴定及其在生长发育过程中的表达分析

为了研究Dof基因家族成员在油梨生长过程中的表达规律，探索和脂肪合成相关的Dof基因成员，本研究以不同生长发育阶段‘哈斯’油梨果实为试材，利用已发表的油梨基因组数据为参考，探索油梨中Dof基因家族成员。结果表明：(1)在油梨中共鉴定到25个Dof家族成员，但蛋白结构差异较大，等电点在5.22～9.77之间，GRAVY在-0.908～-0.143之间；(2)亚细胞定位结果预测发现多数基因定位在细胞核中，部分基因定位在叶绿体及其他位置；(3)生长发育过程中的PaDof1、PaDof2的表达量随着生长不断增加，这和油梨脂肪变化规律一致。由此可见，PaDof1、PaDof2在油梨中可能参与脂肪的合成。本研究结果可为后续的油梨的品质调控提供理论基础。     

一个低氮诱导表达的水稻Dof转录因子OsDof-13的分离和转化

通过生物信息学同源分析,在水稻cDNA数据库中检索到水稻Dof家族中的OsDof-13(AK119803)基因与玉米MNBla转录因子具有很高的同源性.NCBI数据库注释,该基因编码202个氨基酸.依据Dof转录因子共有的特征,N端51～102 AA可能为该基因的Dof结构域.Northern分析结果表明Os-Oof-13受低氮诱导后有明显的表达变化.亚细胞定位分析结果表明OsDof-13蛋白定位于细胞核.构建了OsDof-13的超表达载体,利用农杆菌介导法将其转化粳稻品种合江19,获得12个独立转基因植株,Southern杂交结果显示OsDof-13基因的插入拷贝数分别为1～4个.     

大豆转录因子基因GmDof3的克隆及非生物胁迫诱导表达分析

植物Dof (DNA binding with one finger)转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了探索大豆Dof转录因子与非生物胁迫的关系,本研究利用RT-PCR技术克隆了一个大豆中Dof转录因子基因GmDof3。GmDof3编码含有483个氨基酸残基的蛋白质,分子量为52.91 kD,等电点为8.11。蛋白结构预测发现,该蛋白含有一个典型Dof结合域,定位于细胞核中且含有大量磷酸化位点。进化分析表明大豆GmDof3蛋白与木豆CcDof3蛋白的同源性最高。顺式作用元件预测结果显示,GmDof3启动子序列中含多种逆境响应元件。实时荧光定量PCR表明,高盐、干旱、低温和高温均可诱导GmDof3的表达。本研究结果可以为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。     

基于基因组鉴定小桐子Dof转录因子家族及其表达分析

Dof蛋白是植物特有的C2-C2型锌指蛋白类转录因子,在植物碳氮代谢、次生物质合成、种子萌发及抗逆性等方面发挥重要作用。为全面解析小桐子Dof基因的特征,本研究基于小桐子基因组数据,对Dof基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、保守结构域及差异表达特性等进行了分析。结果表明,在小桐子基因组中共鉴定到24个Dof基因,GSDS基因结构分析显示都包含1(9个)或2(15个)个外显子,聚类分析结果将24个小桐子Dof蛋白分属于4个亚族及7个亚组,其中,有16个(66.7%)Dof蛋白的等电点偏碱性。荧光定量表达分析显示,JcDof1.4L与JcDof5.4L分别在茎与根中高表达,且两者都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照分别提高4.06倍、8.96倍(p0.01)。本研究结果为进一步开展小桐子Dof基因的克隆与功能鉴定提供了依据。     

白桦SAUR基因家族鉴定及生物信息学分析

SAUR基因家族作为植物生长素早期响应基因家族中最大的一个家族,参与到植物细胞伸长、果实发育、胁迫应答等多个生物学过程。本研究基于白桦全基因组数据,对白桦SAUR基因家族进行鉴定和生物信息学分析。结果表明,白桦共有61个SAUR家族基因,这些基因不均匀分布在14条染色体上,理化性质分析表明,大部分BpSAUR蛋白呈碱性,为不稳定蛋白,脂溶性系数较高,为亲水性;系统进化和基因结构分析表明,61个白桦SAUR基因被分为4类(GroupⅠ～GroupⅣ),其中GroupⅣ中BpSAUR基因最多,同一分类的BpSAUR基因更倾向于在染色体上聚集分布,大部分白桦SAUR家族基因为无内含子或少内含子基因。白桦SAUR家族基因启动子还拥有多个光响应、激素响应元件与逆境胁迫作用元件,说明其可能参与白桦生长发育及胁迫应答等多个生物学过程。该家族基因在白桦的不同组织部位和不同发育阶段的表达量也不同,主要在幼茎、成熟茎和成熟叶中集中表达。本研究通过对白桦SAUR基因家族进行深入分析,以期为白桦分子育种奠定良好基础。     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆及生物信息学分析

为了解GM-CSF的基因及蛋白质特性,本研究以pUC-GM-CSF为模板,根据GenBank中登录的GM-CSF序列设计引物扩增GM-CSF基因,随后将其克隆至 pMD18-T载体,并对鉴定正确的重组质粒 pT-GM-CSF进行测序分析,然后对GM-CSF基因进行同源性分析、ORF分析、氨基酸序列分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二级结构预测。结果表明：该基因ORF的全部长度为453 bp,能够编码150个氨基酸,并且在GM-CSF基因所编码的蛋白质中有4个丝氨酸和3个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。同时,GM-CSF蛋白的最大疏水性为2.267,且有8.91%的可能位于细胞外,有0.8%的可能位于细胞壁,有0.24%的可能位于细胞质。同时,该蛋白质的二级结构主要由无规卷曲、α螺旋和延伸链构成。本研究通过对GM-CSF基因进行生物信息学分析,为探究其免疫增强机制奠定基础。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

甘蔗ADP/ATP转运蛋白酶基因克隆及其序列的生物信息学分析

摘要：【研究目的】甘蔗(Saccharum officinarum Linn) 是C4光合途径作物,有着特殊的能量代谢系统,研究其能量代谢过程的ADP/ATP转运蛋白酶基因具有重要的意义。【方法】本研究采用同源克隆原理和PCR技术克隆甘蔗AAC转运蛋白酶基因,并应用生物信息学方法,对其进行多序列比对分析、物理性质分析、三级结构预测、亚细胞定位、跨膜区域预测和疏水性分析。【结果】克隆获得甘蔗AAC cDNA序列全长为1170bp,包括一个可编码387氨基酸的完整ORF。生物信息学分析显示,AAC家族基因的N端序列相对不保守,C端序列高度保守;其的分子量是42.265 kD,理论等电点是9.79,预测其为稳定的蛋白;GRAVY值为-0.099;含有6个跨膜区域;其6个跨膜螺旋(TM1-TM6)跨越磷脂双分子层结构,盐桥可能是通过中间的3个连接螺旋α1-α3共同构成的;定位在细胞质的概率为60.9%。【结论】本研究获得甘蔗AAC 完整ORF序列,并通过生物信息学预测该基因所编码的蛋白为一个稳定跨膜蛋白,其可能定位在细胞质。这些研究为甘蔗AAC基因的深入研究和应用奠定初步基础。     

重叠延伸PCR技术在单碱基定点突变中的作用

氨基酸通透酶(amino acid permease,AAPs)是一种跨膜转运蛋白,广泛参与植物体内氨基酸的吸收与转运。本试验通过重叠延伸PCR技术对氨基酸通透酶基因进行单碱基定点突变,以便为今后研究植物对外源氮的吸收与利用率奠定基础。本研究根据Tair数据库中拟南芥AtAAP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计含有1个突变位点的2对互补的定点突变引物和1对带有pCAMBIA3301-GFP载体的多克隆位点的接头引物,以野生型拟南芥叶片的cDNA为模板,进行3次PCR扩增,将获得的突变基因片段连接到pCAMBIA3301-GFP载体上,转化DH5α感受态细胞。将筛选的阳性菌株送至公司测序,测序结果表明拟南芥AtAAP1基因的第908位碱基A突变为T,实现了单碱基定点突变,这与预计结果相同,说明成功依靠重叠延伸PCR技术做到目的基因的定点突变。该技术能方便快速地获得定点突变序列,为进一步研究AtAAP1基因的功能奠定了基础。     

水稻SAUR23基因的生物信息学分析及其CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

为探索水稻SAUR23基因在水稻生长发育过程中发挥的作用,本研究利用生物信息学分析发现,OsSAUR23编码区长462 bp,编码153个氨基酸,相对分子量为16.89 kD,理论等电点为10.04,是一种不稳定的、亲水性的、非跨膜不分泌蛋白,属于水稻SAUR基因家族的一员;二级结构预测发现Os SAUR23蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主。此外,利用CRISPR-GE在线网站设计一对sg RNA序列,采用自然降温的方法获得双链sg RNA,并在T4连接酶的作用下与线性化载体p HSN401相连,经过菌落PCR以及测序验证表明,针对水稻SAUR23基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。随后,将其转入农杆菌,为遗传转化水稻获得水稻OsSAUR23基因的基因编辑突变体提供实验材料。     

粗山羊草Dof转录因子家族基因的鉴定与分析

Dof(DNA-binding one zinc finger)基因家族是植物特有的一类包含高度保守的C_2-C_2锌指结构域的转录因子,其在植物种子发育与萌发、光、激素以及逆境响应中起到重要调控作用。本研究基于已公布的粗山羊草基因组数据,采用生物信息学方法鉴定了粗山羊草Dof基因,并对其结构、保守结构域、染色体定位、系统进化树和表达谱进行了详细的分析。结果表明:粗山羊草Dof转录因子家族包含10个基因,它们均含有完整的C_2-C_2锌指保守结构域;每个基因含有1~3个内含子,AetDof家族蛋白共包含11个保守的模体;该家族基因除7号染色体外,在其余染色体上均有分布;与拟南芥Dof蛋白构建系统发育树发现,该家族基因可被分为3个亚族;转录组数据分析显示,粗山羊草Dof基因的表达具有组织特异性,其中3个转录因子(AetDof1,AetDof7,AetDof10)在种子中特异性强表达。本研究结果为深入解析粗山羊草Dof基因的功能提供了参考依据。     

犬传染性肝炎病毒IX基因的克隆及原核表达

摘 要：本试验通过对犬传染性肝炎病毒（CAV-I）基因组的提取,通过PCR扩增获得了大小为1109bp CAV-I病毒结构IX基因片段, 成功地将IX基因克隆至载体pMD-18T中,构建了pIX原核表达载体pGEX-4T1-IX,将重组质粒pGEX-4T1-IX转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,并实现了IX基因在该菌中的高效表达。对表达产物进行了Western blot 检测,分析结果表明表达蛋白能与抗CAV-I阳性血清发生特异性的抗原-抗体反应,为CAV-I的血清学诊断和免疫监测提供大量优质的抗原奠定了基础。     

BpERF1.1基因在低温下的表达特性及过表达载体构建

分析白桦BpERF1.1基因不同组织部位以及低温胁迫后的表达模式,定位基因表达部位,并为获得转基因白桦做初步准备.通过实时荧光定量PRC技术测定BpERF1.1基因的相对表达量;利用基因枪法在洋葱表皮细胞瞬时表达35S::BpERF1.1-GFP,激光共聚焦显微镜观察GFP发光情况,获得BpERF1.1基因表达产物的亚细胞定位信息;此外,利用双酶切法将BpERF1.1基因连接到pRokⅡ过表达载体,以及热激法转化到大肠杆菌感受态细胞中.BpERF1.1基因在叶片中相对表达量最高;低温胁迫后的24 h内,白桦BpERF1.1基因持续上调表达;BpERF1.1基因的表达产物定位在细胞核;pRokⅡ-BpERF1.1植物过表达载体菌液PCR的目的 条带位置正确,测序结果BLAST比对后与序列吻合.白桦BpERF1.1基因主要表达部位在叶片,其可以响应低温逆境,且过表达载体pRokⅡ-BpERF1.1构建成功.     

甘蔗新基因ShHXT4克隆亚细胞定位及表达特征

以甘蔗品种新台糖22号为材料,利用同源克隆技术从甘蔗中分离出ShHXT4基因,以GADPH基因为内参,并采用实时定量RT-PCR分析该基因在甘蔗组织中的表达,同时构建亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱表皮的方法对ShHXT4编码的蛋白进行亚细胞定位。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 632 bp,编码540个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为9.16,理论分子量为56.64 k D,命名为ShHXT4,基因编码多肽链中包含信号肽和12次跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码一种转运蛋白。洋葱表皮瞬时表达该基因GFP融合载体表明,ShHXT4定位于细胞膜,组织表达分析显示ShHXT4基因在根、茎和叶中均有表达,叶片中的表达量较高,暗示ShHXT4基因可能在甘蔗叶片糖分转运过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究ShHXT4基因的功能及应用提供帮助。     

蓖麻矮化相关基因RcDof的克隆及分析

为研究Rc Dof基因在蓖麻矮化中的作用及生物学功能,提取蓖麻生长跃变期茎尖中基因组DNA,根据蓖麻中已获得的锌指蛋白基因片段设计引物,采用RACE技术克隆得到该基因,基因完整阅读框全长为924 bp,可编码307个氨基酸,为C2C2型锌指蛋白,预测蛋白质分子量为34.020 9 k Da,等电点为9.23。二级结构预测表明α螺旋占1.63%,β折叠占1.30%,其他无规则卷曲占97.07%,为外释放蛋白。亚细胞定位于细胞核中,对Rc Dof基因的生物信息学分析为进一步研究其在蓖麻矮化过程中的作用机制和功能特征提供理论依据。     

稻瘟病菌未知功能蛋白的序列分析及其过表达载体构建

稻瘟病菌基因组测序的完成有助于全新效应蛋白的挖掘和功能鉴定,而未知功能的蛋白生物信息学预测为这些蛋白的生物学功能鉴定提供了重要的理论参考。本研究利用生物信息学分析对蛋白理化性质分析及其二级结构等进行预测,并构建这四个基因与绿色荧光蛋白(GFP)融合的过表达载体。从稻瘟病数据库中下载MoS4、MoS74、MoS997、MoS1460基因序列,通过分析得到MoS4、MoS74、MoS997和MoS1460基因的ORF分别为281 bp、251 bp、267 bp和240 bp;预测MoS997蛋白属于稳定性较好的亲水蛋白,MoS4、MoS74属于不稳定的疏水蛋白,且MoS74还是一个跨膜蛋白,而MoS1460蛋白则属于不稳定的亲水性蛋白,并且获得了四个基因与绿色荧光蛋白(GFP)融合的过表达载体,并经过测序验证。研究结果为进一步探究稻瘟病菌效应蛋白基因的功能及亚细胞定位等提供科学依据。