碳酸氢盐胁迫对拟南芥根部基因表达的影响

土壤碱胁迫是农作物生长的独特而严重的威胁,对于碱胁迫信号感知、转导和响应的机制,目前仍不清楚。本研究充分利用拟南芥丰富的生物信息资源,对比拟南芥在对照和碱胁迫两种处理下根系转录组的基因表达差异,发现碱胁迫诱导下拟南芥根系3 729个基因表达,抑制了3 828个基因表达。GO和KEGG富集分析表明,钙离子响应和氧化还原平衡等过程在拟南芥碱胁迫响应过程中起重要作用。此外,本研究还发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和钙调蛋白类蛋白等基因与拟南芥碱胁迫反应密切相关。本研究以拟南芥为材料进行系统分析,充分利用了拟南芥丰富的基因资源,为深入了解植物应对碱胁迫的机制提供了理论基础。     

水稻基因OsATS的克隆及功能鉴定

植物胚胎特异性蛋白ATS3和植物的渗透胁迫响应有密切关系,本文对水稻OsATS基因的抗逆相关功能进行了初步研究。qRT-PCR检测发现,水稻在盐胁迫后OsATS基因表达量显著增加。构建OsATS基因过表达载体,转化拟南芥植株,抗逆性检测表明, OsATS基因的过表达可以显著提高拟南芥在萌发阶段和成株阶段的耐盐性。随后将过表达载体p1300-35S:OsATS和RNA干涉载体pTCK303-OsATS-RNAi转入水稻,抗逆性分析表明,OsATS过表达水稻株系在萌发阶段和苗期的耐盐性显著提高,而OsATS基因RNAi水稻株系耐盐性则明显下降。qRT-PCR和生理指标检测表明,OsATS基因的表达可能通过调节OsP5CS1、OsLEA3-1、OsPDH基因的表达,调控了水稻细胞中的脯氨酸、LEA蛋白质含量,进而影响了水稻植株整体的耐盐性。本研究初步揭示了OsATS基因的抗逆功能,后续可通过调整该基因的表达量,改良水稻的抗逆性。     

玉米小分子热激蛋白ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析

植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。     

玉米ZmGRAS31基因的克隆及功能研究

GRAS 蛋白家族是一类植物特有的转录调控因子,在多种植物中均有报道。为了探究玉米 GRAS 基因家族在逆境胁迫下的功能,本研究从玉米根中克隆获得 ZmGRAS31 (AC: NC_024462),该基因全长 1422 bp,编码 473 个氨基酸。生物信息学分析表明 ZmGRAS31 蛋白分子量为 51,700.38 Da,理论等电点为 4.73,具有 GRAS 转录因子家族特有的保守结构域,但不具跨膜结构,亲水性较差。玉米原生质体瞬时表达实验表明 ZmGRAS31 定位于细胞核内。实时荧光定量 PCR (qPCR)分析表明,在低温、脱水、高盐、干旱处理下, ZmGRAS31 在玉米幼苗均上调表达;不同浓度NaCl 处理过表达 ZmGRAS31 转基因拟南芥植株,其根长优于野生型,由此推测该基因可能参与玉米非生物胁迫应答。     

甘蓝型油菜海藻糖磷酸合成酶(TPS)基因家族的生物信息学分析

海藻糖磷酸合成酶(TPS)在植物响应多种非生物胁迫及生物胁迫时起着重要的作用,但目前对甘蓝型油菜中TPS基因的了解甚少。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组中筛选甘蓝型油菜TPS家族基因,对鉴定出的31个BnTPSs基因进行分子特征、蛋白特性、蛋白结构域、保守基序、顺式作用元件、KaKs、染色体定位、系统进化树构建等研究。系统发育分析表明,BnTPS家族分为Ⅰ和Ⅱ类,家族成员数明显比甘蓝、白菜和拟南芥中的TPS基因数多,不规则分布于染色体上。多数蛋白呈酸性,分别在N端和C端具有TPS和TPP结构域。顺式作用元件分析表明,TPS家族与植株抗逆境胁迫有关。KaKs分析表明,大多BnTPSs家族成员有多拷贝基因,基因在纯化选择压力下进化。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜TPS家族基因生物学功能尤其在响应逆境中的功能奠定理论基础。     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

过表达ZmCIPKHT基因增强植物耐热性

高温胁迫对植物正常生长发育及产量的影响越来越显著。为了适应外界环境的变化,植物进化出了一系列应对高温胁迫的分子遗传机制。类钙调磷酸酶B蛋白(CBL)互作蛋白激酶(CIPK),在ABA信号转导途径上积极参与植物对高温胁迫的响应。在前期全基因组关联分析的基础上,本实验克隆了一个与玉米耐高温性状相关的候选基因ZmCIPKHT, qRT-PCR结果表明ZmCIPKHT基因受高温胁迫的显著诱导。室内表型鉴定的实验发现过表达ZmCIPKHT的转基因拟南芥植株在高温胁迫下,比野生型的存活率显著提高,生长状态更好。玉米原生质体瞬时转化实验证明ZmCIPKHT蛋白定位于细胞核中。酵母双杂交实验验证了ZmCIPKHT蛋白与玉米CBLs家族中的ZmCBL4蛋白存在互作关系。同时, ZmCIPKHT转基因拟南芥在高温胁迫条件下,脱落酸(ABA)通路相关基因的表达水平有其相应的变化,揭示了ZmCIPKHT可能依赖于ABA信号转导通路来增强植物的耐热性。这些结果为解析玉米CBL-CIPK信号通路依赖于ABA途径对植物非生物胁迫响应的分子机制提供了新的实验根据。     

Bna-novel-miR311-HSC70-1模块调控甘蓝型油菜响应热胁迫的机制

HSP70(heat shock protein 70)参与植物热胁迫应答,增强植物耐热性,但目前油菜中尚无miRNA调控HSP70基因的报道。本研究novel-miR311是利用高通量技术在甘蓝型油菜茎尖中筛选出的新miRNA。novel-miR311存在于油菜而不存在于拟南芥中, 5'-RACE技术证实其2个靶基因属热应激同源蛋白基因HSC70-1 (HSP70家族),在甘蓝型油菜体内被剪切。构建novel-miR311超表达载体,转化拟南芥和甘蓝型油菜,其转基因阳性苗中HSC70-1基因表达量显著下降。高温胁迫试验表明,拟南芥和甘蓝型油菜热胁迫后,其阳性苗的生长势和存活率显著低于其对应的对照。qPCR结果显示,油菜中HSC70-1基因表达量热胁迫后较热胁迫前上升。上述结果表明,油菜novel-miR311介导HSC70-1基因的剪切降低了拟南芥和甘蓝型油菜耐热性。     

草本拟南芥和木本毛果杨在冷胁迫下的研究进展

低温是影响植物生长发育和限制植物地理分布的重要逆境胁迫因子之一。在冷胁迫下,植物会产生一系列相应的生理生化及分子反应。本研究首先综述了冷胁迫对植物的危害、植物的生理生化反应机制;其次,分别讨论了以拟南芥为代表的草本植物和毛果杨为代表的木本植物,在冷胁迫下的基因表达调控分子机制等相关研究进展;最后,基于转录组分析了冷胁迫下同源基因差异表达方向、ICE1-CBFs分子调控通路在拟南芥和毛果杨中的响应;结果表明,两物种间既存在保守性,又存在多样性。本论文拓展了人们对草本和林木在冷胁迫下的分子进化机理的认识,同时对当前主要采取的以拟南芥基因为参考研究的其他物种同源基因的功能提出了新见解。     

蒺藜苜蓿转录因子MtMYB的克隆、表达分析及拟南芥转化

MYB转录因子家族基因具有保守的DNA结合域,是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的代谢调控,在植物生长发育和胁迫响应等方面发挥重要作用。为改良品种性状和提高生产实践能力,本研究采用RT-PCR法克隆蒺藜苜蓿MYB转录因子基因MtMYB,其编码区长255 bp,编码84个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他物种MYB蛋白具有很高的同源性,其中与红三叶同源性最高。荧光定量结果表明,MtMYB基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。MtMYB基因在外源IAA、6-BA的诱导下,总体都呈现先上升后下降的趋势。同时本研究成功构建35S::MtMYB的植物表达载体,并通过转基因技术将其转化至拟南芥中,PCR检测表明,MtMYB已成功整合至转基因拟南芥基因组中。RT-PCR检测表明,MtMYB能够在转基因拟南芥中正常转录。本研究为进一步探明MtMYB基因的功能提供了数据参考和实验材料。     

拟南芥NSP家族基因序列分析及响应干旱胁迫表达分析

芥子油苷是十字花科植物中的一种重要的次生代谢产物,它被酶水解的降解过程与植物响应逆境胁迫有关。NSP蛋白是一类能与黑芥子酶结合从而改变芥子油苷降解途径最终生成腈类物质的特异蛋白,其与ESP家族蛋白在功能上存在冗余。本研究以拟南芥NSP家族基因为对象,对家族成员基因序列、蛋白质序列、启动子序列进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该家族基因在干旱胁迫下的表达量。结果表明:该家族成员基因分布于3条染色体上,外显子数目2～4个;AtNSP5蛋白亚细胞定位于细胞核,其他成员定位于细胞质;结构域预测显示,该家族蛋白均含有4个Kelch结构域,除AtNSP5外,其他四个成员还含有1～2个Jacalin结构域;启动子序列中均含有CAAT-box、TATA-box核心元件及数量不一的逆境响应元件;干旱胁迫表达量分析显示,该家族中AtNSP5基因受干旱胁迫诱导表达,其他成员响应干旱胁迫不显著。本研究为进一步研究NSP蛋白在植物响应干旱胁迫中的分子机制提供依据,并为植物抗旱基因工程提供潜在候选基因。     

枯草芽孢杆菌对拟南芥的干旱和盐胁迫耐受性的影响

为揭示枯草芽孢杆菌对拟南芥的干旱和盐胁迫耐受性的影响。本研究应用枯草芽孢杆菌QM3对拟南芥和大白菜进行培养,分别对植物进行干旱胁迫和盐胁迫处理,检测植物中干旱和盐胁迫诱导基因的表达,并测量气孔孔径及叶绿素含量。结果显示,干旱胁迫条件下,施用QM3后,拟南芥中4个干旱胁迫诱导基因(RD29B, RAB18, RD20和NCED3)被上调。盐胁迫条件下,QM3导致了拟南芥中盐胁迫标记基因(RD29B, SOS1, RD29A和WRKY8)的高表达。干旱胁迫后,与对照植物相比,经QM3处理的植物的存活率显著升高,而气孔孔径显著降低。此外,盐胁迫处理后,QM3促进了拟南芥的生长,并且升高了叶绿素水平。干旱胁迫后,QM3处理导致拟南芥的侧根数量和长度均增加。在干旱胁迫条件下,用QM3处理显著提高了大白菜的存活率。在盐胁迫条件下,用QM3处理显著提高了大白菜的总叶面积。QM3在干旱胁迫条件下促进了大白菜中干旱诱导基因如BrDREB1D、BrWRKY7和BraCSD3的高表达。本研究表明枯草芽孢杆菌菌株QM3显著增强了拟南芥和大白菜抗旱和盐胁迫的能力,并促进了植物生长。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

水稻OsSUTs基因对弱光胁迫的应答分析

光照对植物的生长发育十分重要,弱光胁迫对水稻生长发育会产生不良的影响。为研究弱光对水稻蔗糖转运蛋白基因(OsSUTs)表达的影响,本研究对水稻品种‘日本晴’进行遮光和不遮光(对照)栽培,检测不同光处理的2组材料OsSUTs基因家族的mRNA相对表达情况、农艺性状和生育期长短。结果显示,弱光胁迫可抑制水稻生长发育进程,导致水稻生育期延长,灌浆受阻;OsSUTs基因家族不同的OsSUTs基因的mRNA表达量对弱光胁迫的应答并不相同。OsSUT1、OsSUT2和Os SUT4对弱光胁迫响应明显,在遮光条件下这3个OsSUTs基因在几个生育期都出现表达量明显上升的情况,这个可能是其上游序列中顺式元件G-box和ACE参与了弱光胁迫响应。本试验结果可为耐荫性水稻品种的分子选育及弱光胁迫下水稻的分子调控机理提供参考。     

拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H_2O_2的长链脂肪醇氧化酶.在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因.然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知.本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000)中的作用.拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜.与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H_2O_2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少.接种病原细菌Pst DC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱.我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用.     

干旱诱导AtGSTF14基因DNA去甲基化

DNA甲基化在调控植物基因表达方面起重要作用。干旱、低温和盐胁迫严重地影响了植物的生长发育。然而,DNA甲基化是否在干旱诱导的AtGSTF14基因表达过程中起作用还不清楚。本研究揭示了干旱诱导AtGSTF14基因启动子重复序列的DNA去甲基化,并激活了AtGSTF14基因的表达。本研究采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测目的基因的表达,结果表明干旱处理的拟南芥植物中AtGSTF14基因表达水平显著增加,野生型拟南芥(Col-0)被作为对照。亚硫酸盐测序分析表明与野生型拟南芥中AtGSTF14基因DNA甲基化水平相比,干旱处理的拟南芥植物中AtGSTF14启动子区重复序列的DNA甲基化水平显著降低。本研究为进一步探索非生物胁迫诱导植物基因表达的分子机制奠定了基础。     

过表达细胞自噬基因ATG8f对植物响应镉胁迫的影响

自噬是广泛存在于真核细胞中对损伤的细胞器和长寿命蛋白进行降解的一条途径。随着近几年工业发展的快速兴起,重金属引发的环境污染和生物健康问题引起了人们的关注。细胞自噬响应逆境胁迫,但是过表达自噬基因对耐受重金属胁迫的影响及作用机理还不清楚。本实验用不同浓度的镉处理野生型Col和ATG8f过表达拟南芥,分析其根长及叶绿素含量差异,从而了解细胞自噬和重金属镉胁迫之间的关系。结果表明:过表达ATG8f基因增加了植物对镉胁迫的敏感性。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

黄瓜CsWRKY23基因的生物信息学及表达分析

WRKY转录因子是植物中广泛存在的一种转录因子,参与植物的生物胁迫与非生物胁迫。采用RTPCR克隆黄瓜CsWRKY23基因cDNA序列,对序列进行结构域、基因结构分析,构建系统发育树,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在黄瓜根、叶组织中的表达。结果表明:CsWRKY23的cDNA开放读码框全长1 431bp,含有5个外显子,4个内含子;编码476个氨基酸,含有两个WRKY结构域,编码蛋白的分子量为52.2kDa、等电点为6.43;系统发育分析表明CsWRKY23与拟南芥AtWRKY33同源。qRTPCR结果表明该基因响应低温胁迫,并在根、叶组织中的表达均上调。本研究为进一步鉴定该基因在非生物胁迫的功能奠定了基础。