小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5＇上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板，用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因（HMW-GS12）的上游调控序列。序列测定结果表明：所克隆的启动子片段大小为917bp，该片段的498～922bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较，同源性为97．9％，有9个核苷酸发生了改变。推测的TATA box位于836～841bp，有3个CAAT-like box，分别是693bp处的CCAA；730bp处的CAAAT和808bp处的CCAT。另外，在684bp存在E-box（TGCAAAG），还有2个E-like box，分别是608bp处的TGCAAAC和510bp处的TGCAAAA。认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5′上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板,用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS12)的上游调控序列。序列测定结果表明:所克隆的启动子片段大小为917 bp,该片段的498~922 bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较,同源性为97.9%,有9个核苷酸发生了改变。推测的TATA box位于836~841 bp,有3个CAAT-like box,分别是693 bp处的CCAA;730 bp处的CAAAT和808 bp处的CCAT。另外,在684 bp存在E-box(TGCAAAG),还有2个E-like box,分别是608 bp处的TGCAAAC和510 bp处的TGCAAAA。认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关。     

月季EPSPS基因的克隆及生物信息学分析

月季是园林绿化中常用的花卉,因此十分有必要对其抗性基因进行研究。5-烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶(EPSP; 3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶; EC 2.5.1.19)为莽草酸途径中的关键酶,也是除草剂草甘膦的靶向酶。为了探究月季EPSPS基因的结构和功能,本研究利用月季基因组信息设计特异引物克隆得到月季的EPSPS基因,命名为RcEPSPS。经RT-PCR克隆后得到RcEPSPS基因的ORF全长为1 566 bp,共编码521个氨基酸,分子质量为55.19 kD,等电点为7.5,亲水系数为0.009。初步研究得知RcEPSPS属于EPSPS I型蛋白,与同属蔷薇科的野草莓的序列同源性极高。研究结果可为后续抗性基因的利用提供理论基础。     

香樟FPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)的cDNA序列,并开展生物信息学分析,为香樟植物萜类物质的合成及调控机理研究提供基础。本研究利用香樟转录组的测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录PCR技术扩增获得香樟FPPS基因,经生物信息学分析,对该基因编码的蛋白进行表征。香樟FPPS基因的开放读码框(ORF)序列全长为1 053 bp,编码350个氨基酸,蛋白分子量为40.42 kD,理论等电点为5.25。香樟FPPS是一个定位于细胞质,不含信号肽的不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域并含有7个保守结构域,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟CcFPPS的氨基酸序列与山苍子、陆地棉和野大豆等植物的FPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析表明,香樟CcFPPS蛋白与樟科植物山苍子FPPS蛋白的亲缘关系最近。本研究首次成功从香樟中克隆了CcFPPS基因并进行了生物信息学分析,为进一步研究CcFPPS基因在萜类合成调控的功能提供理论依据。     

杨树SAMT基因的克隆及生物信息学分析

为了揭示水杨酸甲酯转移酶SAMT (Salicylic acid carboxyl methyltransferase)基因在杨树抗溃疡病中的功能。本研究采用RT-PCR技术和pGM-T克隆的方法,获得了‘84K杨’的SAMT基因序列,并对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能、二级结构及亚细胞定位等进行了生物信息学分析。结果显示:该基因位于细胞质中,属于甲基转移酶7家族,为亲水性蛋白。预测结果为下一步研究该基因在杨树抗溃疡病中的功能提供了帮助,也为其在其他多年生木本植物中的功能研究提供了参考。     

烟草NtGAI基因的克隆及生物信息学分析

赤霉素是重要的植物内源激素,参与植物生长发育中的多个环节。赤霉素可影响烟草中烟碱生物合成,DELLA蛋白为赤霉素信号路径中的一个重要的负调控因子。本研究从烟草(Nicotiana tabacum)基因组中鉴定并克隆到一个烟草DELLA基因NtGAI,该基因CDS长为1 767 bp,编码587个氨基酸。生物信息学分析表明,NtGAI基因没有内含子,其编码的蛋白具有典型的DELLA蛋白结构域,是一个没有跨膜结构的疏水蛋白。聚类分析显示烟草NtGAI与林烟草(Nicotiana sylvestris)及辣椒具有较近的亲缘关系。本研究将为研究烟草中赤霉素调控路径提供有价值的参考数据。     

牦牛FAM134B基因CDS区克隆与生物信息学分析

为了丰富牦牛FAM134B基因研究的基础数据,进一步探讨FAM134B基因的生理功能,通过PCR扩增和测序技术并结合生物信息学分析软件,对牦牛FAM134B基因进行克隆、测序以及相关生物信息学分析。克隆获得1 079 bp的牦牛FAM134B基因,其中CDS区全长1 071 bp(Gen Bank登录号:KM587693),编码356个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛FAM134B基因在CDS区存在3个碱基突变,其中第727位上碱基C→T的突变导致密码子CCC→TCC,使编码的氨基酸由脯氨酸变成丝氨酸。牦牛FAM134B基因编码蛋白的分子式为C1705H2686N448O575S13,分子量为39.077 5 k Da,理论等电点(p I)为4.46,消光系数为24 450。不稳定系数为46.85,疏水指数为79.47,平均亲水性为-0.439,属不稳定可溶性酸性蛋白质。二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,其中α-螺旋占23.88%,无规卷曲占74.72%,属混合类蛋白质。亚细胞定位结果显示:FAM134B编码的蛋白在内质网、细胞质膜、空泡、细胞核、高尔基体、细胞骨架和线粒体中分别占30.4%,21.7%,17.4%,17.4%,4.3%,4.3%,4.3%,推测其可能在物质的运输以及辅因子的生物合成等过程中发挥离子通道载体以及信号转导和转录调控的作用。系统发育树分析表明,牦牛FAM134B氨基酸序列与普通牛、绵羊、小鼠、褐家鼠、猕猴、黑猩猩、人、非洲爪蟾的FAM134B氨基酸序列的同源性分别为99.7%,97.2%,87.1%,86.8%,90.4%,90.2%,90.4%,57.9%,物种间的同源性较高,其系统进化的情况与亲缘关系的远近相一致,说明FAM134B基因的编码区在进化的过程中比较保守。FAM134B基因的成功克隆和分析为揭示牦牛FAM134B基因的遗传特性提供了理论依据。     

玉米中绒毡层发育调控基因ZmUdt1克隆的生物信息学分析

为了研究玉米中绒毡层发育调控基因Udt1的功能与作用,进行生物信息学分析,通过利用Udt1基因培育雄性不育的玉米新品种,来提高杂交种纯度和种质质量并缩短育种年限。该试验采用已知的水稻OsUdt1基因(AY953870.1)为参考序列,使用同源克隆的方式在玉米基因组中得到同源性最高的基因BT068494.1(GenBank),并利用生物信息学方法预测该基因的各级结构以及生物学功能等,同时使用MEGA 7.0程序软件构建分子系统进化树。ZmUdt1基因位于玉米的第2条染色体上,ZmUdt1蛋白由219个氨基酸构成,蛋白的相对分子量为24.48 ku,等电点为5.35,属于亲水蛋白;主要由α-螺旋与无规则卷曲构成二级结构,其三级结构与水稻OsUdt1蛋白的三级结构基本一致,属于HLH超级家族,没有信号肽以及跨膜结构;亚细胞定位预测该蛋白位于细胞核中的可能性较大;通过预测,该蛋白具有翻译、复制与转录、转录调控信号转导等功能,具有17个磷酸化修饰位点,而是否具有其他功能尚没有确定。系统进化树表明,玉米与水稻、高粱等物种遗传距离最近,且与拟南芥的DYT1蛋白也有一定的遗传相关性。通过预测和比较,ZmUdt1和OsUdt1蛋白在结构和功能上具有极高的相似性。研究结果可为进一步研究ZmUdt1蛋白的功能与作用,以及创新玉米的雄性不育系提供理论依据。     

花生AhLRPK1基因的克隆及生物信息学分析

植物受体蛋白激酶参与植物的生长发育,抗逆抗病防御反应、细胞分化、在宿主与病原菌互作过程中起着重要的作用。目前在花生上蛋白激酶基因研究较少。本研究基于前期多态性SNP标记的开发和QTL定位,获得了一个抗青枯病候选蛋白激酶基因;通过RT-PCR克隆技术获得了一段长为2 154 bp的ORF序列,暂命名为AhLRPK1;采用生物信息学方法预测并分析AhLRPK1基因编码的蛋白质常规理化性质,跨膜结构域、进化分析和高级结构等。结果表明AhLRPK1基因编码717个氨基酸为稳定的亲水性蛋白,含有一个信号肽、跨膜结构域、多个LRR基序以及一个激酶结构域;与拟南芥LRR亚家族进化同源性分析显示AhLRPK1属于LRRⅤ亚家族,与拟南芥的AT3G13065蛋白亲缘关系最近;AhLRPK1基因在花生基因芯片中表达模式分析表明,在茎和花中的表达量最大,在青枯菌诱导情况下,AhLRPK1基因在抗感花生品种中都表现出下调表达的趋势,AhLRPK1基因受乙烯利表达下调。这些结果有助于进一步验证其生物功能。     

稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析

旨在克隆稗草对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)基因为探究其基因功能提供基础,从而更好地开发除稗剂。以稗草叶片为材料,用同源克隆和c DNA末端快速克隆(RACE)技术克隆Ec HPPD基因序列,用生物信息学软件分析其特征。Ec HPPD基因的编码序列全长1317 bp,其编码蛋白质由439个氨基酸组成,相对分子质量为46.659 k D,等电点为5.30。稗草与同处禾本科的Dichanthelium oligosanthes(OEL23409.1:8-249)的HPPD蛋白进化程度最为相近。Ec HPPD三级建模蛋白结构由两条链构成,有2个Fe²⁺结合位点,并能与吡唑特活性中心骨架通过氢键相互作用。Ec HPPD可能与HGO、HPT1、TAT3、AT5G36160、TAT7等11个蛋白产生互作。本研究报道了Ec HPPD基因序列并对其进行了生物信息学分析,为创制新的HPPD抑制剂提供理论依据。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。     

丹参SmTIR1基因的克隆及生物信息学分析

生长素受体在植物生长素调控植物生长发育过程中起关键作用,而丹参的生长发育直接影响其品质,但目前有关丹参生长素受体基因的研究仍未见报道.本研究通过克隆获得一条全长1887 bp cDNA序列,并对所获得的克隆序列进行生物信息学分析.丹参生长素受体基因TIR1(命名为SmTIR1)具有典型的TIR1基因结构,通过预测其潜在...     

苜蓿WRKY56基因的克隆及生物信息学分析

WRKY转录因子是高等植物特有的转录因子,也是近年来研究较为广泛的转录因子,且在植物生长、根系发育、果实成熟、衰老等代谢过程中发挥着重要的作用。本研究利用PCR技术克隆到紫花苜蓿(‘WL525HQ’,‘WL712’,‘肇东’)的LbWRKY56和LmWRKY56基因,片段长度均为379 bp左右,编码379个氨基酸,其分子量分别为33.48、30.12 kD;同源序列分析显示与蒺藜苜蓿、白三叶的亲缘关系最近,同源性分别达到97%和93%。RT-qPCR分析其在不同时期不同品种的紫花苜蓿不同组织中的表达特性,结果显示该基因在‘WL525HQ’、‘WL712’和‘肇东’的茎和叶中均有表达。在分枝期和初花期,WRKY56在‘肇东’的茎中的表达量最高,在‘WL525HQ’的叶中的表达量最高。从分枝期至初花期,该基因在茎中的表达量逐渐减少,在叶中表达量逐渐增多;并且该基因在初花期的叶中的表达是急剧上升的,在初花时期相对表达量最多。因此该基因可能在不同时期不同品种苜蓿的不同组织中有促进苜蓿生长发育的作用。     

草原樱桃PGIP基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆草原樱桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,并进行生物信息学分析。以草原樱桃叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,通过PCR扩增获得约1 kb的DNA片段。序列分析表明,该基因全长1 193 bp,包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990 bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列,GenBank登录号为GU068977;该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%～99%。系统进化分析显示,属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。克隆了草原樱桃PGIP基因,为樱桃抗病育种提供一条新的基因资源。     

岷江百合LiGPAT基因的克隆及生物信息学分析

为探索百合的耐盐,耐寒和耐旱的抗性机理,本试验选取了抗寒能力极强的岷江百合(Lilium regale)为材料,利用RT-PCR技术克隆得到了岷江百合的Li GPAT基因的ORF区序列,全长1 212 bp,编码403个氨基酸,分子量约为45.4 k D,Gen Bank登录号为JX524740。通过同源序列比对发现,Li GPAT基因编码的氨基酸与单子叶植物油棕GPAT基因编码的氨基酸的一致性最高,达到67.17%。利用在线软件SMART进行分析,表明Li GPAT氨基酸在169~315序列存在一个Pls C结构域,这就说明Li GPAT蛋白属于酰基转移酶家族成员,且所有的活性位点都位于这个区域,具有酰基转移酶的活性。通过在线软件TMHMM Server 2.0预测分析揭示Li GPAT氨基酸序列不存在跨膜区域,可能是一个可溶性蛋白。利用在线软件Plant-m PLoc预测表明,Li GPAT蛋白质的亚细胞定位为叶绿体。     

欧李ChCBF1基因的克隆及生物信息学分析

本试验在欧李基因组研究的基础上,利用RT-PCR方法从低温处理的‘农大4号’欧李叶片中克隆到了ChCBF1基因,该基因CDS序列长度为690 bp,编码229个氨基酸的蛋白,分子量为25.10 kD,等电点为4.94,蛋白不稳定指数为58.72。二级结构主要由α-螺旋,延伸链,β-折叠和无规则卷曲构成。启动子分析表明,ChCBF1基因的启动子元件包括低温响应元件、多个光响应相关元件以及激素响应元件等一系列诱导型顺式调控元件。通过氨基酸同源比对和系统发育树分析发现,ChCBF1基因编码的氨基酸序列与桃的相似性最高,达到95%。本研究为后续逆境与休眠诱导相关方面的基因功能验证提供了帮助。     

橡胶草SRPP5基因的克隆及生物信息学分析

天然橡胶是产胶植物中合成的聚异戊二烯高分子化合物,而小橡胶粒子蛋白是橡胶粒子膜上参与天然橡胶分子链延伸的关键因子,与橡胶的产量和质量密切相关。本研究利用PCR技术从橡胶草中克隆得到TkSRPP5基因全长序列并进行生物信息学分析。结果表明,该基因含有一个长度为654 bp的开放阅读框,并编码217个氨基酸,所编码蛋白的分子量为23.31 kD,理论等电点为4.58。TkSRPP5为亲水性蛋白,具有24个磷酸化位点,亚细胞定位预测在细胞质中。该蛋白属于SRPP家族,二级结构主要存在α-螺旋和无规则卷曲结构,与预测的蛋白质三级结构一致。系统进化树分析表明,该蛋白与菊苣的SRPP蛋白有着最近的亲缘关系。本研究为进一步了解TkSRPP5基因的功能和其在橡胶草胶乳合成中的作用机制提供了理论依据。     

甜樱桃PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST基因的cDNA序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST基因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明:甜樱桃PaGAST基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。