郁金香ISSR-PCR体系建立与优化

本研究以22个郁金香品种为材料,采用正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶、引物、模板DNA进行4个水平的优化试验。结果表明最佳反应体系为:25μL体系中Mg~(2+)1.0 mmol/L、d NTPs 0.15 mmol/L、Taq酶0.25U、引物0.2μmol/L、模板DNA 100 ng。退火温度为58℃。该体系的建立有利于ISSR分子标记技术研究郁金香种质资源遗传多样性。     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

金莲花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L₁₆(4⁵)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg²⁺、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg²⁺浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg²⁺1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。     

苦瓜ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合于苦瓜的ISSR反应体系,为后续苦瓜的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定奠定基础,本研究以"609"苦瓜品种作为模板DNA,试验采用单因素试验设计对影响反应体系的DNA模板、引物、d NTP和Taq酶的含量进行优化,并对单因素结果进行L9(33)正交试验设计。研究结果表明,苦瓜ISSR:20μL最佳反应体系为:2μL的10×Buffer(含Mg2+),30 ng模板DNA,0.25 mmol/L的d NTP,0.5μmol/L的引物,1.25 U的Taq DNA聚合酶。在此基础上,对优化引物的退火温度,确定最适宜的退火温度。验证优化的最佳反应体系,选用引物cw39132对48个苦瓜品种进行所确立扩增体系的验证,结果显示扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富,且特异性强和重复性好,表明本研究所确定的反应体系适用于苦瓜的ISSR分子标记。     

白芥ISSR-PCR反应体系的建立与优化

本实验以产于四川、安徽、广东和青海的白芥农家品种为材料,采用单因素筛选和L16(45)正交设计相结合的方法,对白芥ISSR-PCR反应体系的Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量进行优化,建立最佳的白芥ISSR-PCR反应体系。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,Mg2+浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、引物浓度0.4μmol/L、模板DNA 60 ng为最佳用量。用4个白芥农家品种对建立的ISSR-PCR反应体系进行验证,表明该反应体系稳定性高、可重复性好,同时筛选出条带清晰、多态性较好的18条引物。该反应体系的建立为白芥ISSR标记开发、种质资源鉴定与筛选、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等提供了帮助。     

藜芦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以藜芦为试验材料,通过L_(16)(4~5)正交试验与单因素实验两种方法对藜芦ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素(模板DNA,引物, Taq DNA聚合酶, dNTPs, Mg~(2+))进行筛选与优化,建立藜芦ISSR-PCR最佳反应体系;在此优化体系下,从100条引物中筛选适宜的ISSR引物,设置温度梯度检测各引物最佳退火温度。结果表明,藜芦20μL ISSR-PCR反应体系包括:0.30μmol/L引物、24 ng/20μL模板DNA、2 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.00 mmol/L Mg2+;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。利用14份藜芦样品验证该优化体系的稳定性,证明该体系稳定可靠,可为后续藜芦的遗传多样性分析研究提供帮助。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

蓝花丹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合蓝花丹的ISSR-PCR反应体系,本研究以蓝花丹为供试材料,结合L_(16)(4~5)正交试验和单因素试验设计对影响蓝花丹ISSR-PCR反应体系的5个因素(dNTPs, Mg~(2+),模板, Taq酶,引物)进行优化,并在最优反应体系的基础之上进行了引物及其最佳退火温度的筛选。结果表明,5个影响因素中,Mg~(2+)对扩增反应的影响最大;不同退火温度对扩增效果具有显著的影响,但将退火温度设置为55℃时,大部分的引物都能扩增出清晰的条带。最终建立的蓝花丹ISSR-PCR反应体系为:总体积25μL,其中含Taq酶1 U,模板DNA 100 ng,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,Mg~(2+)0.5 mmol/L,10×Buffer 2μL。研究结果为蓝花丹及其近缘种的遗传多样性研究以及遗传图谱的构建提供分子标记水平上的依据。     

黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

壳菜果ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立一个稳定、可重复的壳菜果ISSR-PCR反应体系,以壳菜果的总DNA为实验材料,通过单因素实验、正交试验和方差分析对模板DNA浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度5因素进行研究,确定了壳菜果ISSR-PCR反应的最优体系为：在20 μL的反应体系中模板DNA为30 ng,dNTPs浓度为0.20 mmol/L,Mg2+浓度为2.75 mmol/L,引物浓度为0.6 μmol/L,TaqDNA聚合酶为2.2 U。方差分析表明：5个因素中只有Mg2+浓度对反应体系影响最大,达到了显著性水平。     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

砂梨的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以砂梨基因组为材料,通过单因素试脸,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合砂梨的ISSR-PCR反应体系和应用程序为为: 20 μl PCR体系中,1 x Taq 酶配套缓冲液,0.5 U Taq DNA 聚合酶,0.7μmol / L引物,100μmol / L dNTPs,2.25 mmol/LMgCl2,40ng模板DNA。最佳扩增程序为：预变性：94°C 5min; 94°C变性45sec,52°C退火45sec,72°C延伸1min;共40个循环后,最后72°C延伸10min,4°C保存。用引物836可以将这16份砂梨材料区分开。砂梨ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行砂梨品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析莫定了良好基础。     

红芪ISSR-PCR体系的建立及优化

通过单因素与中心复合设计相结合的方法建立优化红芪ISSR-PCR反应体系,并筛选引物,优化电泳时间及扩增循环数。建立的红芪ISSR-PCR反应体系为:25μL反应体系中10×PCR Buffer(Mg~(2+))3.5μL、模板DNA(30 ng/μL)2μL、PCR扩增引物2μL、Taq DNA聚合酶为1.25 U、d NTPs为2μL,dd H_2O 14.5μL,建立的扩增程序:94℃预变性5 min,开始34个循环;94℃变性30 s,后据不同退火温度的引物复性45 s,72℃延伸2 min,循环结束后72℃延伸7 min。本研究筛选出红芪扩增的引物17条;PCR反应产物电泳时间为120 min,最佳循环数为34,建立了稳定的体系,为进一步研究红芪的遗传多样性及遗传结构提供了帮助。     

凤仙花属植物SSR-PCR反应体系的建立与优化

SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

大蒜ISSR-PCR反应体系的正交优化建立

为探寻出更适宜大蒜的ISSR反应体系,以‘弥渡紫皮’大蒜为试材,对ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素（dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度、模板DNA）在4个不同水平上进行正交设计L16(45)优化。结果表明,含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol Mg2+、0.15 mmol dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol引物、20 ng/μL模扳DNA的25 μL反应体系为大蒜的最佳反应体系。利用新建立的反应体系对20个不同大蒜品种进行扩增,具有极好的稳定性和重复性。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材,对影响ISSR-PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg2+,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选.确立了适合刺梨ISSR-PCR分析的最佳反应体系,即20 μL反应体系中各组分浓度分别为:10×buffer2.0 μL,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,dNZPs0.1 mmol/L,引物2.μ mol/L,模板DNA20ng.PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性1 min,48℃退火温度45 s,72℃延伸1 min,34个循环,72℃后延伸6min.利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测,结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好.     

块根紫金牛ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立块根紫金牛ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即25 ul的体系中含Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP0.15 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,模板DNA50ng,10×Buffer 2.5μl.适宜的扩增程序是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56.6℃退火45s,70℃延伸2.0 min;45个循环;72℃延伸7min,4℃保存.采用正交和单因素试验可快速建立ISSR-PCR反应体系.该体系稳定、可靠,可用于块根紫金牛遗传多样性分析.     

濒危藏药桃儿七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为通过ISSR分子标记研究桃儿七遗传多样性,建立并优化桃儿七的ISSR-PCR反应体系。使用正交设计辅以单因素试验,对桃儿七ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA,Mg~(2+),Taq DNA酶,d NTPs及ISSR引物)进行筛选优化,选取甘肃碌曲县西仓神山山顶桃儿七居群样本验证该反应体系。正交试验各因素显著性为引物Taq DNA酶DNA浓度dNTPsMg~(2+),桃儿七ISSR-PCR反应的最佳体系为(25μL):2.5 mmol/L Mg~(2+),0.2 mol/L dNTP,0.4μmol/L引物,0.5 U Taq DNA酶,40 ng DNA,2.5μL 10×Buffer。该体系具有高稳定性,多态性丰富的特点,为野生桃儿七遗传多样性及保护策略研究提供了技术支持。     

山莨菪ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以山莨菪为实验材料,通过正交设计与单因素两种试验方法对山莨菪ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA浓度,Mg2+,Taq酶,d NTPs及引物)进行4水平优化与筛选。经过PCR扩增结果的比较与分析,确定各因素的最适浓度,建立山莨菪的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明,25μL最佳反应体系为:3.0 mmol/L Mg2+、0.2 mol/L d NTPs、0.4μmol/L引物、0.5 U Taq DNA酶、40 ng DNA、2.5μL 10×Buffer。在最佳优化体系条件下,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,并确定各自最佳退火温度。建立的山莨菪ISSR-PCR反应体系,经过11份山莨菪样品检测,证明该体系稳定,可用于山莨菪遗传差异性分析。