甜樱桃AsA合成基因GGP的克隆及在果实发育过程的表达

GGP(GDP-L-galactose phosphorylase)参与植物AsA合成过程。本研究以甜樱桃‘佐藤锦’(Satonishiki)为材料,采用PCR法,首次在甜樱桃上克隆了AsA合成相关基因PacGGP1和PacGGP2,基因片段长度分别为1 297 bp和1 765 bp,分别包含1 107 bp和1 341 bp,并分别编码368和446个氨基酸。通过氨基酸序列比对结果发现,与甜樱桃PacGGP1同源性较高的是枣GGP1,相似度100%,与甜樱桃PacGGP2同源性较高的是碧桃GGP2,相似度在98%左右。采用RT-PCR方法分析了PacGGP1和PacGGP2的表达模式。研究表明PacGGP2基因在‘佐藤锦’甜樱桃品种中的表达变化模式与T-AsA的含量变化趋势表现出明显的相似性,推测它可能是AsA L-半乳糖合成途径中的关键基因,可为甜樱桃分子育种奠定重要基础。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

红花CtANR2和CtANR3基因的克隆、结构及表达模式分析

原花青素是植物中广泛存在的一类黄酮类化合物,是人类膳食的重要营养成分,在防治病虫害方面也发挥着重要作用,花青素还原酶(ANR)是合成原花青素的关键酶。以大果球红花品种为材料,克隆得到2个CtANR基因。生物信息学分析表明,CtANR2和CtANR3的编码区分别为1 020,1 023 bp,对应基因组序列中均含有5个外显子和4个内含子,第1个外显子长度不同,其余4个外显子长度一致,内含子长度差异较大。CtANR2和CtANR3基因编码蛋白质的氨基酸数目分别为339,340个,二级结构都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,都属于水溶性蛋白,但CtANR2蛋白不稳定,而CtANR3为稳定的亲水性蛋白。此外,2个蛋白质都不存在信号肽和跨膜结构,可能定位于细胞外。序列比对及系统进化分析表明,CtANR2和CtANR1同源性最高,亲缘关系最近,3个CtANR蛋白与菊科植物ANR蛋白进化关系最近,与茄科、锦葵科和桑科植物ANR蛋白也同属一个大分支。组织特异性表达分析发现,CtANR2和CtANR1组织表达模式相似,都是在花中的表达量最高,初期果球表达量最低,而CtANR3则在苞片中表达量最高,根和初期...     

小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。     

参薯赤霉素途径基因的克隆与表达分析

参薯是薯蓣科植物,其块茎有较高的营养价值和经济效益。为探究赤霉素对参薯生长及结块影响,本研究对参薯组培苗进行赤霉素处理,统计与对照组相比结薯时间差异;并检测了赤霉素合成及降解相关基因GA20ox、KO、KAO、GA3ox、GA20ox,赤霉素受体GID1基因(4个)和信号传导的DELLA基因(4个)、SPY、SLY1等24个赤霉素途径基因的表达变化。RT-PCR结果显示赤霉素相关基因在叶、茎中都有表达,仅LSH基因在块茎中特异性表达。统计赤霉素处理参薯的结薯时间表明,赤霉素处理的参薯苗结块时间明显提前。RT-qPCR结果显示赤霉素处理后,4个GID1、GA20ox、DELLA2、SNE等基因表达在所有组织或部分组织显著下降,DELLA1和KAO1表达变化不明显,GRF2在块茎中表达上升。试验结果显示外源赤霉素添加对参薯结薯有诱导作用,且对内源赤霉素合成有一定的抑制,可能通过改变参薯赤霉素含量的平衡而提前进入结薯过程,为将来人工控制结薯时间提供科学数据。     

番茄果实果糖激酶基因的克隆及其表达分析

根据GeneBank中已登记的番茄果糖激酶基因的保守序列设计特异引物,以普通栽培型番茄辽园多丽的果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出果糖激酶基因cDNA序列的部分片段并克隆到pBS-T载体中.测序结果表明,LeFRK1-LeFRK3分别与番茄植物中已知该基因的核苷酸序列相似性高达99%以上,构建了一个番...     

漆树TvFAD2基因的克隆与表达分析

植物油酸脱氢酶基因(FAD2)编码的蛋白是负责催化油酸转化为亚油酸的关键脂肪酸去饱和酶,在植物发育、油品质改良及耐逆过程中发挥重要调控作用。为了分离漆树FAD2基因并研究其功能,本研究采用同源克隆法首次从漆树中获得了FAD2基因的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,TvFAD2基因的开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸,具有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。TvFAD2为亲水性蛋白,含有5个跨膜结构域和3个富含组氨酸的保守区域。系统进化树分析表明,漆树FAD2蛋白和盐肤木FAD2蛋白的亲缘关系最近。转录表达水平检测结果表明,TvFAD2基因在主要在漆树的叶和幼果中表达,在幼果中表达量最高,在花蕾期全花和盛花期全花中有低水平的表达。本研究为漆树FAD2基因的进一步利用提供了理论指导。     

白木香AsFPS2基因的克隆与表达分析

沉香(Agarwood)是一种名贵中药和天然香料,倍半萜是其主要的特征性成分之一.法呢基焦磷酸合酶FPS (Farnesyl pyrophosphate synthase)是萜类化合物生物合成的关键酶之一.本研究根据转录组数据在白木香中克隆一个新的法呢基焦磷酸合酶基因AsFPS2,该基因全长1432 bp,包含一个12...     

棉花GhDIS2基因的克隆与酵母表达

棉花纤维由胚珠外被单个表皮细胞分化发育而成,其分化和伸长涉及细胞骨架的重排。本研究根据已报道的植物DISTORTED2基因,同源候选基因法克隆棉花GhDIS2。该基因包括975bpORF,编码324个氨基酸。qPCR分析表明,它在陆地棉TM-1不同来源的组织中均表达,于开花后12d的纤维中达到表达高峰,开花后18d表达开始下降,根和茎的表达量较低。Southern杂交结果表明,GhDIS2在四倍体棉花基因组中存在2个拷贝。克隆GhDIS2到酵母表达载体中,并转化到裂殖酵母中,诱导该基因过量表达,GhDIS2促使细胞扩大。初步推测,GhDIS2和其它植物DIS2功能相似,参与植物细胞肌动蛋白骨架的组装。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

红果醋栗RrFAD2基因的克隆与表达分析

本研究克隆到红果醋栗(Ribes rubrum L.)脂肪酸脱氢酶2(co-3 fatty acid desaturase,FAD2)基因cDNA全长序列,命名为RrFAD2,GenBank登录号为MT795718。RrFAD2全长1470 bp,开放阅读框序列全长1152bp,编码383个氨基酸。生物信息学分析表明,RrFAD2蛋白具有6个跨膜结构域,分子量为43.92 kD,等电点为8.93。利用荧光定量PCR分析RrFAD2基因在红果醋栗不同组织和种子发育中的表达。结果表明该基因在根、茎、叶、花、果实、种子中都表达,在种子中表达量最高,花和根中最低,具有组织特异性。在种子发育过程中,RrFAD2基因的表达先上升后下降,而种子成熟的晚期(花后80 d左右)表达量达到最高。该研究为解析红果醋栗RrFAD2基因功能和研究醋栗不饱和脂肪酸合成提供理论参考。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

桃果实β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达模式分析

胡萝卜素羟化酶是类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶,可以将合成代谢途径中产生的含β-环的类胡萝卜素转化成β-隐黄素和玉米黄素。利用同源克隆技术获得桃果实β-胡萝卜素羟化酶(HYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpHYb。PpHYb基因全长1 405 bp,编码区长933 bp,共编码翻译成310个氨基酸。进化树分析发现PpHYb与草莓FaHYb亲缘性较高。序列分析发现PpHYb与其他物种中的HYb一样,同样含有模体为“HXXXXH”+“HXXHH”的保守基序。实时荧光定量PCR结果显示PpHYb基因在黄肉品种‘金丽’桃果实软核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期中均有表达。当果实处于硬熟期之前时,PpHYb基因在果皮和果肉中的表达逐渐升高并达到最大值;当果实处于完熟期时,PpHYb基因在果皮和果肉中的表达略有下降,且在果皮中的表达显著高于果肉。本研究通过对桃果中PpHYb基因的克隆和表达分析,为进一步研究类胡萝卜素生物合成途径提供了基础。     

甜菜素合成相关基因BvDDC1的克隆与表达分析

甜菜素是一种重要的天然色素,具有广阔的应用前景。为探究调控甜菜素合成关键基因BvDDC1功能,本研究测定了不同生长阶段甜菜‘Yellow chard’的甜菜素含量和BvDDC1的相对表达量,同时采用同源克隆技术获得BvDDC1基因序列,并对其进行生物信息学分析及功能预测。结果表明:甜菜叶片中甜菜素含量随甜菜生长时间的延长呈现上升趋势,且BvDDC1在不同时期甜菜叶片中均有表达,呈现先上升后下降的趋势。甜菜素含量越高,BvDDC1表达量越高。BvDDC1序列全长为1509 bp,编码502个氨基酸,编码蛋白不具有跨膜结构,预测其在膜外发挥作用。系统进化树显示与菠菜亲缘关系较近,同源性最高。本研究结果可为解析甜菜素生物合成提供科学依据。